La technique de sous clonage la plus classique consiste à découper l'insert et le plasmide d'accueil avec les mêmes endonucléases de restriction. Ces enzymes reconnaissent spécifiquement de courtes séquences d'ADN double brin et découpent celui-ci selon des motifs particulier. L'insert et le plasmide ayant les mêmes "motifs de découpage" s'associent facilement et peuvent être "recollés" plus facilement (par la T4 DNA ligase).

Cependant, lorsque l'objectif du sous clonage est de construire une protéine de fusion, il est impératif de respecter le cadre de lecture au moment de l'insertion du gène GFPuv à la suite du gène GST dans le vecteur pGEX4T1. En effet, lors de la traduction, la séquence nucléotidique est transformée en séquence d'acides aminés, à raison de 3 bases pour un acide aminé. Un décalage d'une ou deux bases modifie la séquence de triplet et la traduction est fausse. C'est pourquoi il est essentiel de choisir des endonucléases compatibles avec l'insertion dans la phase de lecture voulue.

  Dans le cas présenté ici, il n'existe pas de sites de restriction spontanément compatibles avec l'insertion en phase de gfpuv dans pGEX4T1. Il est donc nécessaire de créer de nouveaux sites par amplification PCR. En effet, pour modifier les séquences bordant un gène, il est possible d'amplifier celui-ci à partir d'amorces modifiées. Ces amorces ont une séquence très proche de celles bordant le gène avec cependant quelques bases différentes. Ces différences créent de nouveaux site de restriction aux endroits choisis pour les endonulcéases choisies.

Ainsi nous avons choisi d'utiliser un couple d'amorces modifiées baptisées GFPsens et GFPantisens.
GFPsens a une séquence très proche de celle en 5' du gène codant GFPuv, avec cependant un nouveau site de restriction pour l'endonulcéase EcoRI à son extrémité 5'-phosphate.
GFPantisens possède également un nouveau site EcoRI.
La PCR avec ces amorces modifiées permettra l'amplification du gène gfpuv avec de part et d'autre une site EcoRI compatible avec l'insertion en phase dans le site de clonage multiple de pGEX4T1.
 

GAA TTCGGA TCC CCG GTA GAA AAA ATG AGT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT TA GAG GAT CCC CGG GTA CGG GTA GAA AAA ATG AGT	GFPsens Multisite de clonage en 5'
TAA TGAATTCCAACTGAGGTCGACGAATTC TAA TGAATTCCAACTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAACTTGCCTGGTGTCAAAAATAATAGGCCTACTAGTCGGCCGTACGG	GFPantisens Multisite de clonage en 3'

Les bases en rouge sont celles qui ont été choisies pour être différentes de la séquence originale. Les séquences soulignées repèrent les sites EcoRI. Les bases en "gras" indiquent le début de la séquence codant GFPuv.

  Notre choix nous permet d'illustrer une difficulté supplémentaire. En effet, les sites EcoRI de part et d'autre du gène gfpuvpermettent son insertion dans un sens et dans l'autre dans pGEX4T1. Un seul de ces deux sens d'insertion possible est évidemment compatible avec la production d'une protéine chimère.
Lorsque c'est possible, il est recommandé d'utiliser deux endonucléases différentes de part et d'autre pour éviter une étape supplémentaire de discrimination des plasmides après insertion.
De plus, dans notre cas, le site EcoRI en aval du gène gfpuv est situé à l'extrémité 5'-phosphate. Or la plupart des endonucléases ont besoin de quelques bases supplémentaires adjacentes à leur site de reconnaissance pour s'y fixer. Ici, EcoRI a besoin de deux bases quelconques de part et d'autre du motif GAATTC. Il ne lui est donc pas possible d'effectuer la coupure en 5' de l'insert amplifié par PCR. Cette caractéristique nous permet d'illustrer une deuxième stratégie de sous clonage qui n'utilise pas d'endonucléase de restriction.

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