La réaction PCR est réalisée sur 400 ng de plasmide pGFPuv, 240 ng de chaque amorce et 7 unités de Taq DNA Polymerase dans un volume final de 60 µl. 10µl de chaque réaction sont déposés sur un gel de contrôle (Agarose 1% + BET 0.5µg/ml), ci-contre. Piste1 : 4 µl Marqueur de taille (MBI Fermentas). Piste 2 : réaction PCR réalisée sur 400 ng de plasmide (sans huile minérale). Piste 3 : réaction PCR réalisée sur 400ng de plasmide (avec huile minérale). Piste 4 : réaction PCR réalisée sans plasmide. Le contrôle négatif en piste 4 certifie la spécificité de l'amplification PCR. Le fragment d'ADN d'environ 800pb dans la piste 3 correspond à la taille attendue pour le gène gfpuv. Les deux bandes observées en piste 2, dont une correspond à la taille attendue et l'autre beaucoup plus petite sont dues à un artefact réactionnel expliqué dans "Recettes et astuces". Recettes et astuces

Purification de l'insert.

  Le fragment issu de la PCR (insert) est ensuite purifié en déposant le reste du volume réactionnel sur un autre gel agarose 1% puis, après migration, en découpant au scalpel la bande fluorescente correspondante. Le morceau d'agarose contenant l'insert est placé dans un boudin de dialyse pour y subir une électroélution. L'ADN en suspension est alors précipité à froid dans de l'isopropanol, resuspendu dans un plus petit volume et quantifié par spectrophotométrie à 260nm.

Recettes et astuces

  L'insert GFPuv ainsi purifié est mélangé au plasmide pGEMT ouvert dans un ratio (rapport) de 3:1, en présence d'ATP et de la T4DNA Ligase pendant une heure à température ambiante (au mois d'avril il n'est pas rare que la température dépasse 25°C dans les salles de TP !). Ces nouveaux plasmides sont alors introduits dans des bactéries XL1blue (Escherichia coli) par électroporation. Les bactéries effectivement transformées sont devenues résistantes à un antibiotique de sélection du plasmide. Après une incubation de 12 heures à 37°C, les différentes colonies résistantes sont testées afin de vérifier lesquelles ont intégré le vecteur pGEMT vide et lesquelles ont intégré la nouvelle construction. Ce test est fait par simple ouverture du plasmide et migration en gel d'agarose à 1% + BET 0.5µg/ml. Les clones bactériens positifs (ceux recherchés), possèdent un plasmide dont la taille est supérieure de 800pb à celle du plasmide vide.
 

Les clones bactériens ayant proliféré sur milieu sélectif (c'est à dire avec l'antibiotique) solide sont identifiés puis repiqués sur milieu sélectif liquide et remis en culture. Ils subissent ensuite une purification de leur ADN plasmidique après lyse bactérienne suivie d'une précipitation (c'est la "miniprep"). Les préparations de plasmides ainsi obtenues sont digérées pendant une heure par une endonucléase ayant un seul site de clivage dans la construction vide ou "avec insert". L'action d'une enzyme de restriction facilite la lecture puisque le profils de migration electrophorétique d'un plasmide est plus simple lorsque celui-ci est ouvert. Les clones bactériens 5, 7, 9, 11 et 14 (ci-contre), contiennent un plasmide dont la taille correspond à celle de pGEMT-GFPuv. C'est à partir de ces clones que nous poursuivrons l'étude.   Recettes et astuces

 

Sous clonage dans pGEX4T1.

Le gène gfpuv est extrait du plasmide pGEMT-GFPuv par action de l'endonucléase EcoRI. Le fragment ainsi découpé est séparé du reste du plasmide au cours d'une migration électophorétique en gel d'agarose 1%. L'insert est ensuite électroélué et purifié.
En parallèle, le plasmide pGEX4T1 est également ouvert par EcoRI puis déphosphorylé par la phosphatase alcaline. Cette étape de déphosphorylation est essentielle lorsqu'une seule endonucléase est utilisée pour le sous clonage. En effet, la probabilité que le plasmide se recircularise seul est supérieure à celle  qu'il a d'intégrer l'insert. La phosphatase alcaline déphosphoryle les extrémités 5'-phosphate libres, or la T4DNA Ligase a besoin de ce phosphate pour refermer définitivement les plasmides. C'est ainsi que nous pouvons sélectionner les constructions plasmidiques ayant intégré l'insert; elles sont les seules a pouvoir être "recollées".
L'étape de ligation est essentielle pour que le plasmide puisse être introduit durablement dans une bactérie hôte.

Le gène gfpuvdigéré par EcoRI et le plasmide pGEX4T1 ouvert et déphosphorylé sont mélangés avec un ratio de 10:1 en présence d'ATP et de la T4DNA Ligase pendant une heure à 37°C. La même réaction est réalisée, en parallèle, avec le plasmide ouvert déphosphorylé sans insert. Ce contrôle permet d'évaluer l'efficacité de la déphosphorylation et d'en déduire la probabilité d'insertion (si la déphosphorylation est efficace à 100%, tous les clones bactériens capables de se multiplier sur milieu sélectif ont intégré l'insert).

Les clones bactériens transformés avec la construction pGEX4T1-GFPuv peuvent être de deux types selon l'orientation de l'insertion : le gène GFPuv peut être orienté dans le bon sens et donc la traduction donnera la protéine de fusion, ou bien, le gène est inséré dans le mauvais sens et la traduction en "verlen" produira une protéine différente ... ou pas de protéine du tout!
Cette discrimination est possible en réalisant des minipreps des plasmides des clones bactériens résistants puis en découpant ces plasmides avec BamHI. Cette enzyme possède plusieurs sites de restriction sur pGEX4T1 et sur GFPuv et donc les profils de migrations seront différents selon le sens d'orientation. Dans le cas où l'orientation est bonne, des fragments d'ADN de 2 tailles différentes seront observés : 544 et 5205pb. Si l'orientation est mauvaise, 3 fragment seront alors observés : 201 544 et 5004pb.
 

Les plasmides digérés par BamHI sont séparés dans un gel d'agarose à 0,8% (ci-contre). Les clones 2, 3, 4 et 9 possèdent le bon profil de migration, c'est à dire que les clones bactériens correspondant ont intégré le plasmide avec la bonne orientaion, tandis que les clones 1, 5 et 6 possèdent le profil de migration carractéristique d'une mauvaise orientation. Un des clones bactérien intéressant sera utilisé pour la production et la caractérisation de la protéine de fusion.         Recettes et astuces

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