Cette photo (ci-contre), d'un milieu sélectif solide sur lequel a été étalé un mélange de bactéries transformées avec les construction pGEX4T1-GFPuv, montre qu'en absence d'induction, la protéine de fusion GST-GFPuv est synthétisée en quantité suffisante pour pouvoir être détectée.   Il est même possible de séparer les clones fluorescents ayant intégré l'insert avec la bonne orientation, des clones non fluorescents ayant intégré l'insert avec la mauvaise orientation ou n'ayant pas synthétisé suffisamment de protéine pour être fluorescents

Un des clones bactérien ayant intégré la bonne construction pGEX4T1-GFPuv est mis en culture sur milieu sélectif liquide. Lorsque cette culture est en début de phase exponentielle de croissance, la synthèse de la protéine de fusion est induite massivement par ajout d'IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside). Cet analogue structural du lactose induit l'opéron lactose (promoteur Ptac). Après incubation, les bactéries sont détruites et les protéines sont séparées des autres constituants cellulaires.
(L'extrait protéique brut sera soumis à plusieurs traitements successifs : élimination des contaminants nucléotidiques, chromatographie d'affinité puis décrochage par compétition avec du glutathion réduit ou coupure à la thrombine. Un contrôle supplémentaire est ajouté : un clone bactérien possédant le plasmide pGEX4T1 vide subit le même traitement afin d'obtenir la protéine GST seule.)
 

Purification de la protéine chimère.

  L'extrait protéique brut est mélangé à une suspension de billes d'agarose couplées au Glutathion. La partie GST de la protéine de fusion se fixe à son substrat (le glutathion) mais est incapable de le métaboliser. Le complexe ainsi formé (Billes-Glutathion-GST-GFPuv) peut être facilement séparé du reste des protéines solubles par simple centrifugation à faible vitesse. Après quelques lavages, ce complexe peut être rompu soit par compétition (en ajoutant une dose massive de Glutathion réduit) soit par action de la thrombine. En effet, le plasmide pGEX4T1 introduit un site de clivage protéique par la thrombine au niveau de son site multiple de clonage. Cette construction permet de séparer les deux protéines GST et GFPuv.

Recettes et astuces

  L'ajout de Glutathion réduit provoque un déplacement de l'équilibre enzyme-substrat par compétition. En effet la protéine de fusion peut alors se fixer soit sur le Glutathion lié aux billes d'agarose soit au Glutathion réduit libre. Lorsque le Glutathion réduit est ajouté en large excès, cet équilibre est totalement déplacé vers le décrochage de la protéine de fusion des billes d'agarose. Une centrifugation à faible vitesse permet de séparer le culot de billes du surnageant contenant la protéine de fusion en suspension.

Élution par clivage protéolytique

L'action de la thrombine pendant 30 minutes à 37°C sur le complexe billes-Glutathion-GST-GFPuv sépare la partie GFPuv du reste du complexe (Billes-Glutathion-GST). Une centrifugation permet de séparer le culot du surnageant qui contient la GFPuv libre.
 
 
 
 

Cette photographie (ci-contre), correspond à l'étape de lavage des billes d'agarose avec la protéine de fusion fixée dessus. Le tube 1 ne contient que les billes, sans protéine. Les tubes 2 et 3 contiennent les billes et les protéines de deux clones bactériens positifs (contenant le plasmide pGEX4T1-GFPuv correctement orienté). Le tube 4 contient les billes d'agarose Glutathion ainsi que l'extrait protéique d'un clone bactérien transformé avec pGEX4T1 vide. Une fluorescence importante est visible dans les tubes 2 et 3. La faible fluorescence des tubes 1 et 4 est imputable au plastique.

Résultats

  Après dosage des protéines de chaque fraction, la même quantité de protéines est déposée sur des gel d'acrylamide (à 10%) "natifs" (sans SDS) afin d'en séparer les constituants protéiques sans les dénaturer de façon trop irréversible. Après migration, ce gel est observé sous lampe UV pour identifier les bandes fluorescentes. Puis ce même gel est coloré au Bleu de Coomassie afin de révéler toutes les bandes protéiques. Les deux images , fluorescence (ci-dessous à gauche) et coloration (ci-dessous à droite), sont comparées et interprétées ci-dessous.

Recettes et astuces

Obervation sous une lampe UV : fluorescence.

Observation après coloration des protéines : Bleu de Coomassie

Piste 1 : Marqueur de taille. Piste 2 : Extrait protéique du clone bactérien transformé par pGEX4T1 vide, élué par compétition des billes d'agarose. Piste 3 : Extrait protéique du clone bactérien transformé par pGEX4T1 vide et décroché par clivage à la thrombine. Piste 4 : extrait protéique brut du clone bactérien transformé avec pGEX4T11-GFPuv. Piste 5 : extrait protéique du clone bactérien transformé avec pGEX4T11-GFPuv, élué par compétition des billes d'agarose. Piste 6 : extrait protéique du clone bactérien transformé avec pGEX4T11-GFPuv, décroché par clivage à la Thrombine.
 
 

  Le décrochage par compétition de la GST seule (piste 2) fait apparaître sur le gel natif une bande non fluorescente d'environ 20 kDa. L'action de la thrombine (piste 3) laisse de nombreuse bandes non fluorescentes de tailles variables. Il s'agit d'artefacts imputables à la pureté de la thrombine commerciale. Cette piste servira de contrôle négatif de migration pour la thrombine. Parmi les nombreuses bandes présentes dans l'extrait brut (piste 4), une seule protéine d'environ 40 kDa est fluorescente. Après purification par décrochage compétitif (piste 5), il reste encore plusieurs bandes protéiques dont une seule est fluorescente ; sa taille est identique à celle observée en piste 4, mais son intensité est supérieure (pour la même quantité globale de protéine déposée, la proportion de protéine fluorescente est supérieure). Les différentes protéines révélées sur la piste 5 correspondent à des contaminants ayant une affinité pour les billes d'agarose ou le complexe billes-Glutathion-GST-GFPuv, ou bien qui ont été coprécipité au cours des centrifugations. Après décrochage à la thrombine (piste 6), le profil protéique est très proche de celui observé en piste 3. Cependant une bande contenant très peu de protéine (puisque difficile à distinguer après coloration), est très fortement fluorescente. Cette bande d'environ 25kDa correspond à la GFPuv seule. Il est à remarquer que l'intensité lumineuse de la GFPuv seule est supérieure à celle de la GST-GFPuv. En effet, pour une masse moindre de protéine, la fluorescente est beaucoup plus intense.

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