Estimation d'une «charge virale»
[réflexion + connaissances]
On souhaite estimer la quantité d'ADN viral présent dans
un échantillon (échantillon à tester).
Dans cette expérience, l'ADN viral de la souche 57 est quantifié
par PCR à l'aide de deux amorces situées de part et d'autre de la région
codant la sous-unité de surface. Plusieurs expériences
de PCR sont réalisées en présence d'une même quantité de l'échantillon
à tester et de différentes quantités connues d'ADN d'une autre souche du
même virus (souche FB29). Ces deux virus présentent
des sous-unités de surface extrêmement proches (mêmes séquences au
niveau des amorces, même longueur). Cependant, la souche
57 présente un site de restriction pour l'endonucléase EcoRV dans la séquence
à amplifier, qui est absente de celle de la souche FB29.
Après la PCR les produits d'amplification sont soumis à une digestion par EcoRV
puis à une électrophorèse en gel d'agarose pour l'analyse des résultats.
L'ADN est révélé en présence de bromure d'éthidium
et une photographie du gel est prise sous une lampe à ultra-violets :
Légende : Résultat de l'électrophorèse
en gel d'agarose des produits PCR (obtenus à partir de différents
mélanges réactionnels) digérés par EcoRV (pistes
2 à 8) :
1- marqueurs de taille d'ADN
2- témoin sans ADN (remplacé par de l'eau)
3- 100 pg d'ADN de la souche 57
4- 100 pg d'ADN de la souche FB29
5- ADN de l'échantillon à tester + 100 pg d'ADN de la
souche FB29
6- ADN de l'échantillon à tester + 10 pg d'ADN de la souche
FB29
7- ADN de l'échantillon à tester + 1 pg d'ADN de la souche
FB29
8- ADN de l'échantillon à tester + 0,1 pg d'ADN de la
souche FB29
Questions
1) La PCR est-elle, normalement, une technique permettant de
doser l'ADN ? (Justifiez)
2) Pouvez-vous, dans ces conditions, expliquer le principe du
dosage de l'ADN de la souche virale 57 dans l'échantillon à tester ?
3) La précision concernant la très grande ressemblance
des séquences codant les sous-unités de surface des souches 57 et FB29 est-elle
importante ? Si oui, pour quelle raison ?
4) Estimez la quantité d'ADN de la souche 57 initialement
présent dans l'échantillon à tester.
5) Ce type de test peut-être utilisé pour estimer
la «charge virale» dans le plasma de patients infectés par le VIH ou celui
de l'hépatite C. Quelle adaptation faudrait-il prévoir dans le cas de ces virus
?
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