Principe de la RT PCR


Cette fiche présente le principe général de la RT PCR sans entrer dans le détail des (nombreux) choix techniques qui peuvent être faits à chaque étape.

 IMPORTANT : La connaissance du principe de la PCR est posée comme prérecquis à la compréhension du principe de la RT PCR

 
 
 
 
1) Pour réaliser une RT-PCR en tube (par opposition à la RT-PCR in situ), il faut commencer par extraire les ARN et les recopier in vitro en ADNc simple brin.

2) La synthèse du second brin d'ADNc ainsi que la PCR sont effectués dans un deuxième temps par la Taq polymérase (ou par une autre ADN polymérase thermorésistante).

 
1)Synthèse de l'ADNc

La synthèse d'ADNc est catalysée par des transcriptases inverses (reverse transcriptaseRT en anglais).
Ces enzymes sont des ADN polymérases ARN dépendantes, capables d'utiliser un brin d'ARN comme matrice pour catalyser la synthèse du brin d'ADN complémentaire (cf. tableau ci-dessous). Cela correspond effectivement à l'«inverse» d'une réaction de transcription de l'ADN en ARN.
 

ARN
matrice		 Appariement ADNc
synthétisé
A
avec
T
U
avec
A
G
avec
C
C
avec
G

Les transcriptases inverses sont issues de rétrovirus dont elles sont une des principales caractéristiques.
Exemples : la transcriptase inverse du Virus du Myéloblastome Aviaire (AMV), celle du Virus de la Leucémie Murine (Mo-MLV ou Mu-LV).

Comme toutes les ADN polymérases, les transcriptases inverses ne peuvent pas initier seules la synthèse d'un brin d'ADN. Elles ont besoin d'une amorce possédant une extrémité 3'-OH libre. Lorsque les ARN a amplifier sont polyadénylés en 3' (ARNm eucaryotes par exemple), l'amorce choisie peut être simplement une séquence polyT  constituée d'une succession de désoxythymidines (comme sur le schéma ci-dessous en rouge). Dans ce cas, tous les ARNm sont a priori copiés en ADNc.

Remarque : il est aussi possible de réaliser l'étape de transcription inverse directement avec les amorces spécifiques de l'ARN d'intérêt, sans utiliser d'amorce polyT (non illustré). Dans ce cas, l'ADNc obtenu est complémentaire du seul ARN d'intérêt.
 
 

Première étape : synthèse de l'ADNc

Schéma simplifié du principe de la réaction de transcription inverse en présence d'amorce polyT

 
 
 
 
2)PCR
Selon les protocoles (nombreux et variés), il est recommandé d'inhiber la réaction de transcription inverse et de détruire ou dénaturer l'hybride ARN/ADNc.

Dans un premier temps, la Taq polymérase catalyse la synthèse du second brin d'ADNc en utilisant le premier brin comme matrice.

Ensuite, la PCR permet d'amplifier le fragment d'ADNc.
 

Remarque : Certaines ADN polymérases ADN dépendantes thermostables comme celle de Thermus thermophilus (Tth), ont naturellement une activité transcriptase inverse en présence d'ions manganèse. D'où l'idée d'effectuer la réaction de transcription inverse et la PCR dans le même tube et avec la même enzyme.
(Nous ne discuterons pas ici des avantages et inconvénients respectifs de cette méthode).

La synthèse du second brin d'ADNc ainsi que la PCR sont effectués dans un deuxième temps par la Taq polymérase

Le produit final est un ADN dont l'un des brins est complémentaire de l'ARN d'intérêt et l'autre brin a lmême séquence que cet ARN d'intérêt (à la substitution près de U par T).

 

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