Cette partie se fait en parallèle sur un clone bactérien transformé avec pGEX4T1-GFPuv et un clone bactérien transformé par pGEX4T1 vide.

    Synthèse de la protéine de fusion.

Les clones bactériens choisis sont mis en culture à raison de 0,2ml de suspension bactérienne saturée dans des tubes de culture contenant 15ml de milieu de culture (LB + antibiotique) et placé à 37°C jusqu'à ce que les cultures aient atteint une DO600nm d'environ 0.5 (cette DO traduit alors le début de leur phase exponentielle de croissance des bactéries). 75µl de solution d'IPTG (0.5mM final) sont ajoutés dans chaque tube et l'ensemble est remis en culture pendant 3 heures.

A la fin de l'incubation, les bactéries sont récupérées par centrifugation (5 minutes à 400rpm). Le culot bactérien est repris par 1ml de solution native de lyse [tampon natif ( Tris pH8 100mM, NaCl 150mM, NaH2PO4 4mM, Na2HPO4 16mM, antiprotéases 43ng/ml) + 1mg/ml de lysozyme]. Ce mélange est passé au sonicateur (4 "pulses" de 15 secondes), puis centrifugé 5 min à 14000 rpm. Le surnageant limpide constitue alors la fraction protéique brute.

    Chromatographie d'affinité.

20mg de billes d'agarose glutathion (Sigma) sont resuspendus dans 5ml de tampon PBS et placées 12 heures à 4°C. Après une centrifugation de 4 minutes à 2000rpm, les billes sont reprises par 500µl de tampon natif et conservées à 4°C.

L'extrait protéique brut est ajouté aux 500µl de matrice et incubé sous agitation douce à 4°C pendant une heure. Les billes sont récupérées par centrifugation à 2500rpm pendant 1 minutes puis lavées trois fois par 500µl de tampon natif pendant 10 minutes. Après le dernier lavage, le culot est prêt pour l'élution par compétition ou par clivage protéolytique.

    Élution par compétition.

Une solution de Glutathion réduit (Sigma) est préparée à 20mM dans du tampon Tris pH8 100mM, NaCl 120mM et antiprotéases 43ng/ml. Le culot de billes d'agarose glutathion sur lesquelles sont fixées les protéines de fusion est alors repris par 50µl de solution de glutathion réduit et mis en agitation à 4°C pendant une 30 minutes. Une centrifugation de 5 minutes à 2000rpm permet de séparer les billes du surnageant qui contient la protéine de fusion. Le culot est à nouveau repris par 50µl de Glutathion réduit et remis à incuber afin de décrocher le maximum de protéines de la matrice. Les deux surnageants sont rassemblés, puis les protéines sont dosées par la méthode de Bradford.

    Élution par clivage protéolytique.

Le culot de billes d'agarose est repris par 100µl de solution de thrombine (NaCl 150mM, CaCl2 2.5mM, Tris pH8 50mM, thrombine 1mg/ml) et placé 30 minutes à 37°C. Après une centrifugation de 5 minutes à 2000rpm, le surnageant est récupéré et les protéines sont dosées par la méthode de Bradford.

Les billes d'agarose glutathion peuvent être conservées d'une séance à l'autre (année à l'autre) selon les recommandations du fournisseur.

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