Recommandations :

    Une réaction PCR n'est validée qu'en présence d'un contrôle négatif, où l'eau remplace la matrice à amplifier. Cela permet d'identifier des contaminations par l'ADN de votre matériel ou de vos solutions. La PCR étant une réaction de type exponentielle, un petit grain de sable, formera une dune en fin de réaction.

    Afin d'éviter le pipetage de petits volumes (< 2µl), il est conseillé de réaliser des "premix". Il s'agit de mélanger dans un tube commun, les réactifs communs à chaque réaction, puis de répartir le volume adéquat de ce mélange dans chaque tube réactionnel et d'y ajouter la matrice à copier.

   La Taq DNA Polymerase est une enzyme extrêmement dépendante de la température. Elle se conserve à -20°C et doit constamment être dans la glace. En effet, un réchauffement provoque une mise en route de l'activité enzymatique de façon plus ou moins efficace. C'est pourquoi, l'enzyme doit toujours être ajoutée au dernier moment et placée immédiatement dans les conditions d'amplification.

Exemple :

Pour une PCR sur 2 échantillons d'ADN + 1 témoin négatif :
Il faut 5µl de l'ADN 1 et 10µl pour l'ADN 2.

Tube n°1 : 5µl d'ADN 1 + 5µl H2O
Tube n°2 : 10µl d'ADN 2                        Les trois tubes sont conservés dans la glace
Tube n°3 : 10µl H2O

   Préparation du Prémix :
3 volumes H2O
3 volumes Tampon
3 volumes de MgCl2
3 volumes dNTP
3 volumes de chaque amorce
3 volumes de Taq

immédiatement après addition de l'enzyme, 1/3 du premix est ajouté dans chaque tube réactionnel. Les tubes sont ensuite placés dans le thermocycleur.

Pourquoi de l'huile Minérale?

Les résultats présentés pour la réaction PCR, montrent que l'amplification n'a pas correctement fonctionné en absence d'huile minérale. Pourquoi?
Le thermocycleur utilisé pour la réaction ne possède pas de couvercle chauffant. Or cette option est essentielle car elle permet d'éviter l'évaporation en cours de réaction. La solution consiste donc a ajouter une goutte d'huile minérale sur le volume réactionnel. La couche d'huile au dessus du mélange permet d'éviter toute évaporation. Dans la piste 2 du gel de contrôle, l'huile n'avait pas été ajoutée. Au cours des différents cycles d'amplification, l'eau s'est évaporée, modifiant ainsi les conditions salines du milieu réactionnel. Or l'enzyme ne fonctionne efficacement que dans des conditions strictes de salinité et de pH. En conditions non optimales, si elle accepte de fonctionner, elle génère des erreurs plus ou moins nombreuses (cf. deuxième piste).

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