Le système pGEMT vector commercialisé par Promega a été optimisé pour son utilisation dans un ratio insert:vecteur de 1:1. Cependant, au cours de votre premier essai de sous clonage, un ratio de 3:1 semble être un bon rapport initial, les conditions pouvant être optimisées à partir de ce résultat.

    La détermination de la masse d'insert à mélanger au plasmide est calculée suivant l'équation suivante :
(ng de vecteur ? taille en kb de l'insert) ? 3 = ng d'insert
              taille en kb du vecteur               1

Protocole :
Mélanger dans un microtube de 0,5ml
 5µl de tampon 2X Rapid Ligation Buffer, T4DNA Ligase
 1µl de pGEMT vector (50ng)
 xµL d'insert (à déterminer)
 1µl de T4DNA Ligase (3unités)
 ajuster le volume final à 10µl avec de l'eau desionisée.
Le mélange est incubé une heure à température ambiante.

Remarques :
Une réaction de sous clonage doit comporter des contrôle de ligation. Un contrôle négatif ne contenant pas d'insert permet d'évaluer le bruit de fond, c'est à dire la probabilité pour laquelle le plasmide se referme sur lui même
Un contrôle positif peut être réalisé en mélangeant un insert ADN contrôle fournit dans le kit. Celui-ci a été optimisé pour un très bon taux d'insertion. Ce contrôle permet de tester l'efficacité de la T4DNA Ligase.

Astuces :
De même que pour la PCR, vous pouvez être amené à réaliser un prémix, vous devez conserver l'enzyme dans la glace et l'ajouter en dernier.
De manière générale, on ajoute les ingrédients de valeur croissante dans le prémix.
 
 

Transfert des nouveaux plasmides dans une bactérie.
 
 

Après le sous clonage, il y a dans le tube un mélange des différents plasmides ouverts et fermés. Afin de séparer toutes ces constructions, nous allons les introduire dans une cellule procaryote. Il est essentiel de respecter les conditions de concentrations, température et durée pour avoir statistiquement une construction par bactérie. Les bactéries les plus utilisées sont des souches d'Escherichia coli (XLIblue, DH5a) dites compétentes, dont la paroi peut être perforée par un choc osmotique, thermique ou électrique. Ici, nous avons utilisé les bactéries électrocompétentes XLIblue stockées à -80°C en condition optimales de croissance et de salinité.
 

Dans une cuve d'électroporation, sont mélangés 40µl de culture bactérienne et 2µl de mélange de ligation (contenant environ 100ng de plasmide). La cuve est placée dans l'électroporateur et y subit un choc électrique de 1,8kV pendant quelques secondes. Sur le mélange sont ajouté 200µl de milieu de culture sans antibiotique de sélection (milieu LB), puis placé en incubation pendant une heure à 37°C. 20µl de se mélange sont ensuite étalés sur une boite de milieu LB solide + antibiotique de sélection et mis en culture pendant 12 heures à 37°C

Attention: il est essentiel de respecter la proportion volume de solution plasmidique et volume total car une concentration saline trop élevée provoquerait un arc électrique.

L'étalement uniforme des bactéries sur milieu sélectif, peut se faire suivant plusieurs techniques. Le volume de 20µl est trop faible (une goutte ne va pas s'étaler), il faut diluer la suspension bactérienne dans un volume suffisant pour l'étaler (~1ml). Pour étaler il est possible d'utiliser un râteau, c'est à dire une pipette pasteur coudée, ou bien des billes de verre stériles.

Sélection des clones positifs.

Après l'incubation de 12 heures à 37°C, les clones ayant intégré une construction plasmidique et donc résistants à l'antibiotique de sélection, ont donné des colonies isolées (si l'étalement est correct). Quelques colonies isolées (dont le nombre est déterminé en fonction de vos contrôles), sont repiquées à l'aide d'une pipette pasteur stérile dans un milieu sélectif liquide (5-10ml de milieu LB + ATB), identifiés et remis en culture 12 heures à 37°C. C'est à partir de ces cultures que les plasmides seront préparés (minipreps). Attention : il est impératif de conserver une fraction aliquote des cultures bactériennes pour relancer les cultures une fois le bon clone identifié.

  Minipreps de plasmides.

5ml de préculture sont centrifugées 5 min à 4000rpm afin de récuperer un culot bactérien visible. Ce culot est repris dans la dernière goutte de surnageant puis 100µl de solution P1 y sont ajoutés (Tris pH8 25mM, EDTA pH8 10mM). agiter doucement par renversements. Ajouter 100µl de solution P2 (NaOH 0.2N, SDS1%), mélanger doucement par renversements. Ajouter 100µl de solution P3 (Acétate de potassium 3M, Acide acétique glacial 2M) et mélanger doucement par renversements. Le mélange est centrifugé 5 minutes à 14000rpm afin de séparer le culot contenant les débris cellulaires, du surnageant où se trouvent les plasmides. Les acides nucléiques de petites tailles sont précipité à froid par ajout d'un volume d'isopropanol et 1/10 de volume de LiCl 5M. Afin d'éliminer les ARN, le culot est repris par 25µl de tampon Tris 10mM EDTA 1mM contenant de la RNase A (10µg/ml) et incubé 30 minutes à 37°C.

Les plasmides sont a nouveau purifiés par ajout d'un volume de phénol-chloroforme. Après centrifugation, la phase aqueuse est débarrassée de la plupart des protéines. Une dernière précipitation à froid avec de l'isopropanol permet de récupérer un culot de plasmides purifiés. Ce culot est à nouveau repris par 25µl de tampon Tris EDTA et stocké à -20°C.

  Sélection :

A partir des minipreps des différents clones, il est possible de sélectionner ceux qui ont intégré l'insert dans leur construction plasmidique. Leur taille étant supérieure de 800pb, les constructions recherchées migreront moins loin que les plasmides vides. Pour faciliter la lecture de l'électrophorèse, il est conseillé de linéariser les plasmides : ceci évite les différentes formes super enroulées.

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