Utilisation de la PCR pour le sous clonage et l'expression d'un gène d'interêt

     Le sous clonage est une technique utilisée couramment en biologie moléculaire. Elle consiste à insérer dans un nouveau vecteur un fragment d'ADN déjà isolé par ailleurs.

Dans le cadre des travaux pratiques de l'option PCB du Magistère des Sciences de la Matière de l'École Normale Supérieure de Lyon, nous produisons une protéine de fusion correspondant aux deux protéines GST (Glutathion-S-Transférase) et GFPuv (Green Fluorescent Protein) collées bout à bout.

Dans ce but, nous extrayons le gène gfpuv de son plasmide d'origine pGFPuv (Clontech) puis nous modifions les séquences bordant ce gène par PCR (Qu'est ce que la mutagénèse par PCR ?).
Le gène ainsi amplifié et modifié sera tout d'abord inséré dans le plasmide pGEMT (Promega).
Cette étape intermédiaire nous permet d'illustrer une technique de clonage qui utilise le principe de mutation des amorces de PCR.
Le gène gfpuv modifié sera à nouveau extrait du plasmide pGEMT par l'action d'endonucléases et enfin sous cloné en aval de la séquence codant la GST et en phase avec elle dans le plasmide pGEX4T1.
La nouvelle construction nucléotidique sera introduite dans un hôte procaryote afin que celui-ci synthétise la protéine chimère.
L'étude se terminera par la purification (par chromatographie d'affinité) et la caractérisation de la protéine de fusion.
 
 

1