La GFP (Green Fluorescent Protein) est une protéine spontanément fluorescente produite par certaines méduses du Pacifique telle que Aequorea victoria.

Constituée de 238 acides aminés, la protéine sauvage possède deux pics d'excitation à 395 nm (UV proche) et 475nm (bleu), mais un seul pic d'émission à 508nm (vert).La fluorescence est attribuée à l'existence de réarrangements spontanés au niveau de la séquence d'acides aminés : Ser65-Tyr66-Gly67.  Récemment différentes protéines mutantes de la GFP ont été produites. Elles apportent des modifications d'ordre quantitatif comme une augmentation de l'intensité de la fluorescence, ou qualitatif comme l'apparition de formes fluorescentes jaunes, bleues ou rouges. Ici nous utiliserons la protéine GFPuv ayant un seul pic d'excitation à 395nm et un pic d'émission à 509nm (vert) et dont l'intensité de fluorescence est 18 fois celle de la protéine GFP sauvage.  Le gène codant la GFPuv est déjà cloné dans le plasmide pGFPuv (Clontech) (figure 1).

La GST (Glutathion-S-Transferase) est une enzyme qui fixe et métabolise le glutathion.
Cette protéine est largement utilisée en biologie moléculaire pour la fabrication de protéines de fusion.
En effet, grâce à son activité enzymatique, il est possible la purifier par chromatographie d'affinité.
Son substrat, lié de façon covalente à une matrice insoluble, permet toujours la fixation de la GST mais n'est pas hydrolysable.
L'enzyme reste donc fixée à la matrice qui peut être facilement récupérée par centrifugation.
Le gène codant la GST est déjà cloné dans le plasmide pGEX4T1 (Pharmacia Biotech) (figure 2).

Le sous clonage de la GFP dans pGEX4T1 permettra donc d'obtenir une protéine fusion alliant, a priori, les caractéristiques de chacune des protéines : la fluorescence de GFPuv et la facilité d'une purification par affinité de la GST. Cette protéine chimérique sera produite dans une souche bactérienne XL1 blue : il s'agit d'une souche d'Escherichia coli qui a la particularité de pouvoir intégrer des plasmides après un choc électrique (électroporation = faire des trous avec un choc électrique).

pGEMT (figure 3) a été mis au point afin de réaliser le clonage des produits PCR. Ce vecteur est fournit sous forme ouverte (coupé par EcoRV) et additionné de thymidine aux extrémités 3' terminales. Ce plasmide contient de nombreux sites de restriction à l'intérieur de son MCS (Multi Cloning Site). Ces sites de restriction permettent l'extraction de l'insert par digestion.

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