Maxiprep

Lorsque la discrimination des clones positifs pGEMT-GFPuv a permis d'identifier un clone bactérien satisfaisant, celui-ci est remis en culture dans un grand volume de milieu sélectif liquide (100ml de LB) afin de d'extraire une grande quantité de plasmide (maxipreps).

  -Centrifugation de la culture à 4000rpm pendant 5 minutes.
  -Après avoir vidé le surnageant, le culot est repris par 10ml de solution P1 (pour faciliter cette étape, il est conseillé de garder les dernière gouttes de surnageant, d'y resuspendre le culot par agitation au vortex puis d'ajouter la solution P1).
  -10ml de solution P2 sont ensuite ajoutés puis l'ensemble est agité doucement par renversement avant d'être incubé pendant 10 minutes à température ambiante.
  -10ml de solution P3 sont ajoutés, mélangés doucement au reste et mis à incuber 10 minutes dans la glace.
  -Au cours de ces étapes P2 et P3, il est important de ne pas trop agiter ; cela casserait l'ADN génomique et contaminerait la préparation de plasmides.
  -Le mélange est alors centrifugé 10 minutes à 4000rpm.
  -Le surnageant contenant des débris visqueux est filtré sur gaze (si nécessaire), puis recentrifugé
  -1 volume d'isopropanol est ajouté et placé 20 minutes à -20°C afin de faire précipiter les petits acides nucléiques.
  après une centrifugation de 15 minutes à 4000rpm, le culot est lavé puis repris par 1ml de tampon Tris EDTA + RNase et mis à incuber 1 heure à 37°C.
  -Une extraction au phénol chloroforme (1 volume) et une nouvelle précipitation à l'isopropanol terminent cette préparation de plasmides. Ceux-ci sont repris dans 500µl de tampon Tris EDTA puis quantifiés par dosage spectroscopique à 260nm.

  Le dosage DO se fait à une dilution dans l'eau de 1/100 ou 1/200, à 260nm et 280nm contre de l'eau. Le rapport DO260/DO280 doit être supérieur à 1,8 pour certifié dune préparation suffisamment propre (peu de protéines).

  Extraction de l'insert.

Le gène GFPuv est extrait du plasmide pGEMT-GFPuv par action le EcoRI (10 unités MBI Fermentas) pendant une heure sur 1µg de plasmide. L'insert est ensuite séparé de son vecteur par migration électrophorétique sur gel d'agarose 0,8%. La bande correspondante est alors découpée, l'ADN est électroélué puis précipité à l'isopropanol, repris dans 20µl de tampon Tris 10mM, EDTA 1mM.
[La quantification de l'insert est faite par observation de 1µl de la préparation sur un gel d'agarose, par comparaison d'intensité de bandes avec le marqueur de taille calibré].

  Ligation dans pGEX4T1.

1µg de plasmide pGEX4T1 a été digéré par 10 unités de EcoRI pendant une heure à 37°C puis déphosphorylé pendant 40 minutes à 37°C par la phosphatase alcaline. Ces enzymes sont ensuite désactivée à 65°C pendant 10 minutes puis éliminées au phénol chloroforme. Le plasmide linéaire et déphosphorylé est déposé sur un gel d'agarose et purifié comme l'insert.

pGEX4T1 ouvert et l'insert sont mélangés dans un ratio de 1:10 en présence d'ATP, de T4DNA Ligase et de son tampon. Le mélange est placé 12 heures à 16°C puis introduit dans des bactéries XLIblue.

  Discrimination des clones positifs.

Après une incubation de 12 heures à 37°C, les clones bactériens sont observés très rapidement sous lampe U.V. pour visualiser une possible fluorescence non induite.
Des colonies fluorescentes ou non sont prélevées et remises en culture pour réaliser des minipreps. Les différents clones plasmidique sont coupés par BamHI pendant une heure à 37°C puis déposés sur un gel d'agarose afin d'observer les profils de migration. Parmi les clones ayant un profil attendu, une souche est mise en culture pour la production de la protéine de fusion.
Il est intéressant de constater que les colonies exprimant une fluorescence résiduelle ont toutes présentées le bon profil. Il semble donc que la protéine de fusion qui nécessite normalement une induction (promoteur de l'opéron lactose), est cependant traduite en quantité suffisante pour être visible à l'oeil nu. Ce phénomène illustre le fait que l'induction ou l'inhibition n'est pas un phénomène du tout ou rien, mais comme souvent en biologie une résultante d'un équilibre beaucoup-peu.
 

[les protocoles sont détaillés dans la partie sous clonage dans pGEMT]

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