Au cours d'une réaction PCR, la Taq polymérase réalise une copie fidèle d'un brin d'ADN à partir d'une amorces. Or a la fin de chaque élongation d'amorce, la Taq polymérase a la particularité d'ajouter un nucléotide adénosine (A) en 3'. Ainsi, à la fin de la réaction, le produit PCR majoritaire est un ADN double brin avec à chaque extrémité 3'OH une base adénosine libre.

Le plasmide pGEMT a été conçu pour sous cloner directement les produits d'amplification PCR. Il est commercialisé sous forme ouverte avec à chaque extrémité 5'-phosphate une base thymidine libre. De sorte que les adénosines libres en 3'OH des inserts peuvent s'associer avec les thymidines libres du plasmide. Après action de la T4 DNA Ligase, le produit PCR est définitivement inséré dans le plasmide pGEMT-GFPuv.

A présent le site EcoRI situé en 5' du gène GFPuv possède des bases adjacentes de part et d'autre. L'endonucléase peut donc s'y fixer et découper le gène gfpuv.

Après purification, nous disposerons du gène gfpuv avec des motifs EcoRI en 3' et en 5'. Mélangé au plasmide pGEX4T1 lui même digéré par EcoRI, il pourra alors s'y insérer. Ce second sous clonage donnera un mélange de plasmides pGEX4T1-GFPuv, parmi lesquels nous devrons sélectionner les bonnes orientations ... ce qui ne devrait pas être trop difficile si les clones positifs sont fluorescents ...

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