Souad ZREIKA
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Nov 30, 2021
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Chaque cellule d’un organisme doit faire des choix définissant son destin, choix entre prolifération, différenciation, mais aussi survie ou mort. Afin de mieux comprendre le processus de différenciation, notre équipe a précédemment réalisé des analyses d'expression génique par RT-qPCR en cellule unique (scRT-qPCR) sur des progéniteurs érythrocytaires primaires de poulet (T2EC). Ces études ont montré une augmentation de la variabilité de l’expression génique pendant les 24 premières heures du processus de différenciation, phase durant laquelle les cellules ont gardé la capacité de s’autorenouveler avant de s’engager irréversiblement en différenciation. De plus, l’application de l’outil WASABI sur les données de scRT-qPCR des T2EC en différenciation a permis d’inférer 364 réseaux de régulation de gènes (GRN) candidats qui sous-tendent ce processus. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail de thèse a été de mieux caractériser moléculairement la dynamique de la différenciation des T2EC et de définir le GRN qui décrit au mieux ce processus. Ainsi, dans la première partie de ce travail, nous avons analysé par scRT-qPCR et MARS-seq, le transcriptome des T2EC induites à se différencier pendant 24h puis replacées en milieu d’autorenouvellement (T2EC en réversion). L’analyse des données d’expression par différents outils bioinformatiques, a montré une très forte similarité entre les T2EC en réversion et les T2EC constamment maintenues en état d’autorenouvellement. Néanmoins, les cellules en réversion ont gardé une marque de leur engagement dans le processus de différenciation en activant l’expression de gènes liés à la voie de synthèse de l'hème. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons cherché à générer de nouvelles données d’expression à l’échelle de la cellule unique afin de définir au mieux le GRN sous-jacent au processus de différenciation des T2EC. Dans ce but, nous avons réalisé des expériences de Knock Out (KO) du gène FNIP1 (Folliculin Interacting Protein 1) dont le positionnement est le plus incertain entre les réseaux obtenus avec l’outil WASABI. A l’échelle de la population cellulaire, ce KO affecte la prolifération des T2EC mais n’a pas d’effet notable sur leur différenciation. A l’échelle de la cellule unique, nous avons pu établir un protocole strict de validation au niveau génomique et transcriptomique du KO et obtenir récemment 2 clones KO pour FNIP1 en cours d’analyse par scRT-qPCR. En conclusion, ce travail a permis de mieux caractériser la différenciation érythrocytaire et la réversibilité de destin des T2EC qui n’ont pas encore atteint un état stable de différenciation, processus dirigé par le comportement dynamique et stochastique d’un GRN sous-jacent dont la structure reste à définir.
Mots clés : T2EC, différenciation, Réversion, scRT-qPCR, MARS-seq, GRN, KO, FNIP1.
Abstract
During development, cells choose the most appropriate fate between proliferation, differentiation, survival or death. To better understand the differentiation process, our team has previously performed single cell RT-qPCR (scRT-qPCR) gene expression analyses on primary chicken erythrocyte progenitors (T2EC). These studies showed an increase in gene expression variability during the first 24 hours of the differentiation process, a phase during which the cells retained the ability to self-renew before irreversibly committing to differentiation. Furthermore, the application of the WASABI tool on scRT-qPCR data of differentiating T2EC allowed to infer 364 candidate gene regulatory networks (GRN) underlying this process. In this context, the aim of this work consists in better molecularly characterizing the dynamics of T2EC differentiation and defining the GRN that best describes this process. In the first part of this work, we analyzed by scRT-qPCR and MARS-seq, the transcriptome of T2EC induced to differentiate for 24 hours and then put back in self-renewal medium (reversed T2EC). The analysis of the expression data by different bioinformatics tools, showed a strong similarity between reversed T2EC and T2EC constantly maintained in self-renewal state. Moreover, reversed cells retained a mark of their involvement in the differentiation process by activating the expression of genes related to the heme synthesis pathway. In the second part of this work, we sought to generate new expression data at the single cell level to better define the GRN underlying the T2EC differentiation process. To this end, we performed Knock Out (KO) experiments of FNIP1 (Folliculin Interacting Protein 1) gene whose positioning is the most uncertain between the networks obtained with the WASABI tool. At the population level, this KO affects T2EC proliferation but has no significant effect on their differentiation. At the single cell level, we have been able to establish a strict protocol for KO validation at the genomic and transcriptomic level and recently obtained 2 KO clones for FNIP1 that are being analyzed by scRT-qPCR.
In conclusion, this work has allowed us to better characterize the erythrocytic differentiation and fate reversibility of T2EC that have not yet reached a stable state of differentiation. Those processes are driven by the dynamic and stochastic behavior of an underlying GRN whose structure remains to be defined.
Keywords: T2EC, differentiation, reversion, scRT-qPCR, MARS-seq, GRN, KO, FNIP1