Cette thèse de doctorat traite de la conception et de l’évaluation de sondes moléculaires fluorogènes répondant à des activités enzymatiques dans des contextes biologiques d’intérêt. Ces sondes à trois composantes (un substrat enzymatique, un espaceur, un fluorophore) présentent un fort rapport signal sur bruit (grâce à son système OFF/ON), et une excellente rétention du signal au siège de l’activité enzymatique grâce à la libération d’un fluorophore précipitant, l’ELF-97. Des premiers résultats in vitro et in cellulo, très encourageants pour des sondes répondant à des peptidases ou glycosidases, ont récemment été obtenues dans l’équipe. Par conséquent, l’objectif de ces travaux est double. Le développement de nouveaux fluorophores avec des émissions décalées dans le rouge ou le proche infra-rouge par rapport à l’ELF-97 fera l’objet d’étude du premier volet, dans une optique d’expériences in vivo et/ou de multiplexing. L’incorporation des candidats les plus prometteurs ainsi développés dans des sondes modèles répondant à la β-galactosidase constituera naturellement le second chapitre. Enfin, l’amélioration de la sensibilité des sondes par modification structurale des espaceurs constituera le dernier volet de ces travaux, par l’incorporation de charges positives ou grâce à la stratégie du multiple release.