Comment un facteur de transcription spécifie-t-il différentes fonctions dans différentes couches cellulaires ? Le modèle de PhDEF dans le pétale du Pétunia

Résumé de la thèse

PhDEF (Petunia hybrida DEFICIENS) est un gène homéotique codant pour un facteur de transcription de type MADS-box, nécessaire à la spécification de l’identité pétale chez Petunia hybrida. En effet, le mutant phdef présente une conversion homéotique des pétales en sépales. PhDEF est exprimé tout au long du développement des pétales, mais la façon dont il contrôle les multiples aspects de ce processus (croissance, pigmentation, différenciation cellulaire) est inconnue. Il a été constaté que l’expression spécifique de PhDEF dans l’épiderme ou le mésophylle des pétales conduit à des phénotypes radicalement différents : l’expression spécifique de PhDEF dans le mésophylle affecte fortement le développement des lobes de la corolle (phénotype star) alors que l’expression spécifique de PhDEF dans l’épiderme affecte fortement le développement du tube de la corolle (phénotype wico). Ce résultat indique que la fonction de PhDEF est différente dans les deux couches cellulaires des pétales et que PhDEF participe au développement indépendant du tube et des lobes. Ce modèle d’étude original résonne avec une question centrale en biologie du développement : quels sont les mécanismes moléculaires par lesquels les facteurs de transcription donnent aux cellules leur identité dans différentes couches cellulaires ? Cette question est particulièrement pertinente chez les plantes à fleurs, où le méristème est organisé en couches (L1, L2, L3) clonalement indépendantes, héritées dans tous les organes floraux.

Afin d’élucider les déterminants moléculaires de la fonction spécifique de PhDEF dans les couches cellulaires du pétale, Emma DÉSERT a réalisé une immunoprécipitation de chromatine suivie d’un séquençage (ChIP-seq) pour déterminer si PhDEF avait des gènes cibles différents dans les deux couches cellulaires. Elle a constaté que PhDEF se lie et régule plus de gènes dans l’épiderme que dans le mésophylle. En examinant les gènes exprimés de manière différentielle chez star et wico par rapport aux fleurs sauvages dans des données bulk RNA-seq et scRNA-seq générées précédemment, elle a constaté que la liaison couche cellulaire spécifique de PhDEF n’était pas toujours corrélée avec la régulation spécifique des gènes cibles de PhDEF dans cette même couche cellulaire, suggérant l’existence d’autres mécanismes que la simple liaison de PhDEF. Elle a initié des approches pour identifer les partenaires protéiques de PhDEF spécifiques de l’épiderme ou du mésophylle en adaptant et optimisant un protocole de co-immunoprécipitation de PhDEF ; et elle a également cloné des constructions génétiques pour effectuer le marquage de proximité basé sur la biotine ligase TurboID des interacteurs de PhDEF. Elle a également dessiné une expérience de Chromosome Conformation Capture (3C)-qPCR pour détecter des boucles de chromatine entre les sites de liaison du PhDEF sur le même gène spécifiquement dans une couche cellulaire. Elle a généré des lignées transgéniques pour caractériser la localisation de la protéine PhDEF au cours du développement précoce des pétales par microscopie confocale, et elle a constaté que la protéine PhDEF semblait plus présente dans l’épiderme par rapport au mésophylle, par opposition à la présence homogène du transcrit PhDEF dans les deux couches cellulaires. Ceci suggère l’existence d’un mécanisme actif d’enrichissement de la protéine PhDEF dans l’épiderme, et est en adéquation avec le fait que PhDEF se lie à davantage de gènes dans l’épiderme.

Dans l’ensemble, les résultats de la thèse d'Emma DÉSERT montrent que les fonctions couche cellulaire spécifiques de PhDEF dépendent en partie de son expression et de sa liaison accrues dans l’épiderme par rapport au mésophylle, mais ce sont également d’autres mécanismes moléculaires (comme des partenaires protéiques spécifiques à une couche cellulaire) qui pourraient expliquer la régulation complexe et couche-dépendante des gènes cibles de PhDEF qui sont impliqués dans le développement des pétales du pétunia.

How does a transcription factor specify different functions in different cell layers ? The model of PhDEF in the petal of Petunia

PhDEF (Petunia hybrida DEFICIENS) is a master homeotic regulator coding for a MADS-box transcription factor, necessary for the specification of petal identity in Petunia hybrida. Indeed, the phdef mutant presents a homeotic conversion of petals into sepals. PhDEF is expressed throughout petal development but how it controls the multiple aspects of this process (growth, pigmentation, cell differentiation) is unknown. It has been shown that PhDEF specific expression in the epidermis and mesophyll cell layers of the petal results in dramatically different phenotypes: mesophyll-specific expression of PhDEF strongly affects petal limb development (star flowers) while epidermal-specific expression of PhDEF strongly affects petal tube development (wico flowers). This finding indicates that PhDEF function is different in the two petal cell layers and participates in the independent development of the tube and limb. This original model of study resonates with a central question in developmental biology: what are the molecular mechanisms by which transcription factors give cells their identity in different cell layers? This question is particularly relevant for Angiosperms, whose meristem is organized in clonally independent cell layers (L1, L2, L3) and inherited in all floral organs.

In order to elucidate the molecular determinants of PhDEF layer-specific function in the petal, Emma DÉSERT performed Chromatin-immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) to determine whether PhDEF had different target genes in the two cell layers. She has found that PhDEF binds and regulates more genes in the epidermis than in the mesophyll. Looking at differentially expressed genes in star and wico flowers compared to wild-type in previously generated bulk RNA-seq and scRNA-seq data, she saw that layer-specific binding of PhDEF was not always correlated with layer-specific regulation of PhDEF target genes, suggesting the existence molecular mechanisms other than simple PhDEF binding. She initiated approaches to identify PhDEF layer-specific protein partners by adapting and optimizing a co-immunoprecipitation protocol of PhDEF, as well as cloned genetic constructions to perform TurboID-based proximity labelling of PhDEF interactors. She also designed Chromosome Conformation Capture (3C)-qPCR experiment to detect layer-specific looping between PhDEF binding sites on the same gene, which could drive its layer-specific expression. She generated transgenic lines to characterize PhDEF protein localization during early petal development in both cell layers by confocal microscopy, and saw that PhDEF expression seemed enriched in the epidermis compared to the mesophyll, contrary to PhDEF transcript homogenous presence in both cell layers. This result suggests the existence of an active enrichment mechanism of PhDEF protein in the epidermis, which is consistent with the fact that PhDEF binds more genes in the epidermis.

Overall, Emma DÉSERT's PhD thesis results show that PhDEF layer-specific functions partly rely on its enhanced expression and binding in the epidermis compared to the mesophyll, but they are also other molecular mechanisms (like layer-specific protein partners) which could explain PhDEF complex layer-dependent regulation of genes involved in petunia petal development.