Des nanodomaines membranaires aux domaines polaires : régulation de la dynamique membranaire des Rho GTPases et leur impact sur la signalisation

Résumé de la thèse

Les Rho GTPases sont des régulateurs centraux d'une grande variété de processus intracellulaires, notamment l'organisation du cytosquelette, la polarité cellulaire, la morphogenèse et les voies de signalisation. Ces petites GTPases alternent entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. Une fois activées, les Rho GTPases interagissent avec des protéines effectrices qui déclenchent des réponses cellulaires spécifiques. Une question clé du domaine est de comprendre comment la spécificité du signal est assurée en aval de l’activation. Au cours de mes recherches doctorales, j'ai étudié cette question en comparant deux Rho GTPases végétales étroitement apparentées : ROP2 et ROP6 d'Arabidopsis thaliana. Malgré leur forte similarité de séquence, ainsi qu'une expression et une localisation membranaire qui se chevauchent dans les mêmes types cellulaires, ces protéines régulent des réponses cellulaires distinctes, voire parfois antagonistes. ROP2 et ROP6 sont toutes les deux activées par la phytohormone auxine. Ces deux ROP et en particulier leur voie de signalisation médiée par l’auxine, offre ainsi un système unique pour étudier les mécanismes de spécificité de la signalisation des Rho GTPases. Dans ce projet, nous nous sommes concentrés sur la dynamique membranaire de ROP2 et ROP6. En utilisant la microscopie confocale et à super-résolution, il a été démontré précédemment que l'auxine induit le nanoclustering de ROP6 au niveau de la membrane plasmique des cellules épidermiques racinaires, et que ces nanodomaines de ROP6 sont nécessaires à la signalisation. Bien que l'auxine active également ROP2, nous n'avons pas observé de nanoclustering clair de ROP2 au niveau de la membrane plasmique dans les mêmes cellules. En revanche, ROP2 est polarisée de façon précoce au niveau du domaine d'initiation des poils racinaires (root hair initiation domain - RHID), formant un domaine polaire distinct à la membrane des trichoblastes, correspondant au futur site d’émergence des poils racinaires. La formation de ce domaine polaire de ROP2 au RHID est essentielle au développement des poils racinaires. À l’inverse, ROP6 se polarise également au RHID, mais de manière beaucoup plus tardive et avec une intensité réduite, et n’est pas essentiel à la formation des poils racinaires. Nous avons donc émis l'hypothèse que les différences observées dans la dynamique membranaire de ROP2 et ROP6 pourraient être à l’origine de leurs fonctions spécifiques dans les cellules. Nous avons généré une série de constructions chimériques, échangeant différentes régions entre ROP2 et ROP6, afin d’identifier les déterminants génétiques, soit les parties protéiques responsables de leurs différences en termes d’organisation spatiale et de comportement dynamique à la membrane plasmique. Étonnamment, la région la plus variable des protéines, la queue C-terminale hypervariable, qui détermine également l’association membranaire dans les ROP, ne contrôlait pas leur localisation. Nous avons découvert que les extrémités N-terminales fortement conservées constituent les déterminants clés des modèles de polarisation distincts de ROP2 et ROP6 au RHID, ainsi que de leurs réponses en termes de nanoclustering. Grâce à une caractérisation détaillée des mutants rop, nous avons identifié des phénotypes ROP distincts. Nous avons pu ainsi démontrer que l’extrémité N-terminale de ROP2 est essentielle à son rôle dans le développement des poils racinaires. Ainsi, cette étude établit que des changements très fins au sein des séquences N-terminales des ROP peuvent avoir un impact important sur leur dynamique membranaire, conduisant essentiellement à un passage d'une organisation en nanodomaines à une localisation en domaines polaires. De plus, ces résultats suggèrent que les changements dans la dynamique membranaire entre les isoformes des ROP sous-tendent leur fonction spécifique dans les cellules, offrant ainsi un aperçu de la diversification fonctionnelle des Rho GTPases.

From membrane nanodomains to polar domains:regulation of Rho GTPase membrane dynamics and their impact on signaling output

Rho GTPases are master regulators of a variety of intracellular processes, including cytoskeleton organization, cell polarity, morphogenesis, and signaling pathways. These small GTP-binding proteins cycle between an inactive GDP-bound form and an active GTP-bound form. Upon activation, Rho GTPases interact with downstream effector proteins that mediate specific cellular output. A key question in the field is how signal specificity is achieved downstream of their activation. During my PhD research, I investigated this question by comparing two closely related plant Rho GTPases, ROP2 and ROP6 from Arabidopsis thaliana. Despite their high sequence similarity, overlapping expression and plasma membrane localization within the same cell types, these proteins regulate distinct, sometimes antagonistic, cellular responses. Furthermore, both ROP2 and ROP6 are activated by the phytohormone auxin but regulate different cellular functions following activation. Therefore, these two ROPs and particularly the auxin-mediated signaling pathway represent a valuable system to investigate the mechanisms behind Rho GTPase signaling specificity. In this project, I hypothesized that the differential regulation of ROP2 and ROP6 membrane dynamics may explain their specific functions. Employing confocal and super-resolution microscopy, auxin was previously shown to trigger ROP6 nanoclustering at the plasma membrane of root epidermal cells and that these ROP6-nanodomains are required for signaling. While auxin also induces ROP2 activation, I did not observe a clear ROP2 nanoclustering response at the plasma membrane of root epidermal cells. However, ROP2 undergoes early polarization at the root hair initiation domain (RHID), forming a distinct polar domain at the plasma membrane of trichoblasts at the future root hair emergence site. The formation of this ROP2-polar domain at the RHID is essential for root hair development. In contrast, I showed that ROP6 polarizes at the RHID with delayed timing and reduced intensity, and is not essential for root hair development. These data suggest that the observed difference in membrane dynamics of ROP2 and ROP6 may underlie their specific functions in cells. Next, I addressed the genetic determinants in ROP2 and ROP6 that explains their difference in membrane dynamics.  Generating a series of chimeric constructs that exchange protein parts between ROP2 and ROP6, I analyzed which regions of the proteins determine their differences in spatial organization and dynamic behavior at the plasma membrane. Surprisingly, the most variable regions of the proteins, the hypervariable Ctail, which also determines membrane binding in ROPs, did not control their localization. Instead, I found that the highly conserved N-termini of ROPs are key determinants of the distinct polarization patterns of ROP2 and ROP6 at the RHID, as well as their nanoclustering responses. Through detailed characterization of rop mutants, we identified distinct ROP phenotypes and investigate whether the conserved N-terminus is also required for proper ROP function. Indeed, I demonstrated that the ROP2 N-terminus is essential for its role in root hair development. Altogether, this study establishes that very conservative changes within ROP N-terminal sequences can have a strong impact on their membrane dynamics, essentially leading to a switch from a nanodomain organization to a polar domain localization. Furthermore, my results suggest that this switch in membrane dynamics between ROP isoforms likely underscores their specific function in cells, thereby providing a window into the functional diversification of Rho GTPases.