Dynamiques des réponses interféron de type I et III contre les infections virales à la résolution unicellulaire

Résumé de la thèse

La réponse interféron (IFN) constitue un pilier central de la défense antivirale, mais sa régulation spatio-temporelle au niveau unicellulaire reste mal comprise. Les virus respiratoires tels que le métapneumovirus humain (hMPV) et le virus de la rougeole (MeV) illustrent bien ce défi : tous deux dépendent de l’évasion des réponses IFN pour se propager, tandis qu’un sous-ensemble seulement de cellules épithéliales infectées ou exposées initie la production d’IFN. Cette hétérogénéité – provenant du caractère stochastique de l’infection et de la variabilité de l’induction des IFN et des gènes stimulés par les interférons (ISG) – reste mal caractérisée, en grande partie faute d’outils permettant de suivre en temps réel l’activation dynamique. Ici, nous avons développé et validé l’« ISG-timer », un rapporteur d’imagerie en temps réel conçu pour analyser la dynamique des IFN de type I et III au niveau unicellulaire. Il associe deux protéines fluorescentes de demi-vies différentes, exprimées sous le contrôle d’un promoteur d’ISG, permettant la détection simultanée des cellules « répondeuses actives » (transcrivant actuellement des ISG) et des « répondeuses passées » (précédemment activées mais désormais silencieuses). En dépassant les limites des rapporteurs transitoires, l’ISG-timer permet un suivi rétrospectif des réponses ISG dans le temps et l’espace. L’utilisation de l’ISG-timer dans des modèles d’épithélium des voies respiratoires en interface air-liquide (ALI) nous a permis de définir certains paramètres cinétiques de la réponse IFN. Contrairement aux études précédentes, la stimulation par IFN-β n’a pas conduit à des réponses « digitales » mais à une activation homogène et progressive de l’ensemble de la population cellulaire. Concernant les infections par hMPV et MeV, l’ISG-timer a révélé des signatures IFN distinctes et spécifiques à chaque virus. Alors que l’hMPV induisait une réponse IFN rapide et puissante, le MeV entraînait une activation retardée des ISG, associée à ses effets cytopathiques et à des dommages mitochondriaux. Dans les deux cas, l’issue de la réplication virale était déterminée par le moment et l’intensité de l’induction des ISG. Ces données expérimentales seront essentielles pour construire une modélisation mathématique mécanistique visant à reconstituer les étapes clés de la voie IFN, de la détection virale et la sécrétion d’IFN jusqu’à l’amplification paracrine et l’induction des ISG. Une fois calibré avec les données de l’ISG-timer, ce modèle devrait capturer la variabilité à l’échelle unicellulaire et populationnelle, et fournir des informations sur la manière dont quelques cellules sentinelles peuvent protéger des domaines épithéliaux via la diffusion d’IFN, et comment les mécanismes de rétroaction contribuent probablement à la résolution de la réponse. En conclusion, l’ISG-timer fournit une plateforme universelle pour observer la dynamique transcriptionnelle dans des cellules vivantes. Ses applications futures pourraient dépasser la biologie des interférons. Il ouvre des perspectives pour l’étude des interactions hôte-pathogène dans des cocultures épithéliales-immunitaires, le criblage d’antiviraux et des stratégies personnalisées pour les patients présentant des réponses IFN dysrégulées. Plus généralement, il permet de disséquer la régulation transcriptionnelle spatio-temporelle dans tout processus où la dynamique unicellulaire détermine les résultats au niveau de la population.

Dynamics of type I and III interferon responses against viral infections at single-cell resolution

The interferon (IFN) response is a central pillar of antiviral defence, yet its spatio-temporal regulation at the single-cell level remains poorly understood. Respiratory viruses such as human metapneumovirus (hMPV) and measles virus (MeV) exemplify this challenge: both depend on evading IFN responses to spread, while only a subset of infected or exposed epithelial cells initiates IFN production. This heterogeneity – arising from the stochastic nature of infection and from variability in IFN and interferon-stimulated gene (ISG) induction – remains poorly characterized, largely because tools to monitor dynamic activation in real time have been lacking. Here, we developed and validated the “ISG-timer”, a live-imaging reporter designed to analyse type I and III IFN dynamics at the single-cell level. It combines two fluorescent proteins with different half-lives expressed from an ISG promoter, allowing simultaneous detection of active responder cells (currently transcribing ISGs) and past responders (previously activated but now silent). By overcoming the limits of transient reporters, the ISG-timer enables retrospective tracing of ISG responses across time and space. Using the ISG-timer in liquid and air-liquid interface (ALI) airway epithelial models, we defined several kinetic parameters of the IFN response. Unlike previous reports, IFN-β stimulation did not lead to digital responses but rather to a homogeneous and progressive activation of ISG expression across the cell population. Relatively to hMPV and MeV infections, the ISG-timer revealed distinct IFN signatures that are virus-specific. While hMPV induced a quick and potent IFN response, MeV caused a delayed ISG activation, associated with its cytopathic effects and mitochondrial damage. In both cases, viral replication outcomes were shaped by timing and magnitude of ISG induction. Our experimental data will be instrumental to build a mechanistic mathematical model, with the aim of reconstructing key steps of the IFN pathway, from viral sensing and IFN secretion to paracrine amplification and ISG induction. When calibrated with ISG-timer data, the model should capture both single-cell and population-level variability and provide insights into how sentinel cells may protect epithelial domains through IFN diffusion, as well as how feedback mechanisms likely contribute to resolution of the response. In conclusion, the ISG-timer provides a universal platform for observing transcriptional dynamics in living cells. Future applications could go beyond the interferon biology. It opens perspectives for studying host-pathogen interactions in epithelial-immune co-cultures, antiviral drug screening, and personalized strategies for patients with dysregulated IFN responses. More generally, it enables the dissection of spatio-temporal transcriptional regulation in any process where single-cell dynamics shape outcomes at population level.