Intégration temporelle de l'information auxine au niveau du méristème apical caulinaire d'Arabidopsis thaliana : caractérisation aux échelles cellulaire et génomique

Résumé de la thèse

Le méristème apical caulinaire (MAC) est une structure localisée au sommet de la tige, responsable de la formation de tous les organes aériens de la plante au cours de sa vie. Il est composé d’un groupe de cellules souches entouré par une zone organogénétique, dans laquelle les futurs organes sont rythmiquement déterminés par des accumulations locales périodiques d’auxine - une phytohormone. Des travaux récents pionniers du laboratoire RDP ont contribué à la caractérisation de la dynamique de l’auxine. Par une approche de microscopie quantitative sur MAC vivants, il a été démontré qu'à l'échelle tissulaire, la relation entre signalisation auxine et réponse à l’auxine est complexe et non-linéaire : dans la zone organogénétique, les cellules ne déclenchent pas directement une réponse transcriptionnelle à l’auxine lorsqu’elles y sont exposées, mais y répondent avec un délai d’environ 12 heures. Une exposition continue à l’auxine pendant plusieurs heures est par ailleurs nécessaire au déclenchement d’une réponse transcriptionnelle. Cela suggère que le traitement du signal auxine par les cellules du MAC passe par un processus d'intégration temporelle, conduisant ces cellules à ne pas répondre aux niveaux instantanés d'auxine, mais plutôt à sommer au cours du temps leur exposition d'auxine pour générer une réponse transcriptionnelle. Le but de ce travail de thèse est de caractériser plus finement ce processus d'intégration temporelle, aux échelles cellulaire et génomique.

À l'échelle cellulaire, nous avons poussé plus loin l'approche de microscopie quantitative ayant permis de démontrer l'intégration temporelle. Via un suivi temporel de MACs vivants par imagerie confocale sur le temps long, combiné à un nouvel algorithme de traçage cellulaire, nous avons pour la première fois pu obtenir des trajectoires de cellules méristématiques, et quantifier les dynamiques d'auxine et de réponse transcriptionnelle à l'auxine au sein de ces trajectoires, avec une excellente résolution temporelle. L'étude de la réponse transcriptionnelle avec un rapporteur synthétique, DR5, et un rapporteur endogène, AHP6 (ARABIDOPSIS HISTIDINE PHOSPHOTRANSFER 6), nous a permis de caractériser différentes trajectoires d’auxine et de réponse transcriptionnelle ; ainsi que leur organisation spatiale à l’échelle du MAC. Par des méthodes de calcul intégral, nous avons pu (1) reconstituer des cartes d’intégrale d’auxine dans le MAC ; (2) estimer des paramètres clés associés au traitement cellulaire du signal auxine ; (3) montrer qu’à certains temps développementaux, l’intégrale d’auxine est un meilleur prédicteur de la réponse transcriptionnelle que l’auxine instantanée ; et (4) décrypter la relation intégrale/réponse à l’entrée de la zone organogénétique, ainsi que dans les futurs organes aux stades précoces de développement.

À l’échelle génomique, une approche de bulk RNA-seq sur MACs traités avec de l’auxine pendant différentes durées nous a permis d’analyser la dépendance au temps de l’expression des gènes cibles de l’auxine, ainsi que la dynamique temporelle globale de la réponse transcriptomique à une exposition à l’auxine. En croisant ces données de bulk RNA-seq avec des données de ChIP-seq sur MONOPTEROS - un facteur de transcription de la voie de signalisation de l’auxine essentiel dans le MAC -, nous avons pu caractériser différentes classes de cibles directes de l’auxine. Certains gènes sont sensibles à 2 heures d’exposition à l’auxine, tandis que d’autres nécessitent de plus longues durées d’exposition pour être régulés. Cela suggère que l’intégration temporelle de l’information auxine n’est pas un mécanisme restreint aux rapporteurs que l’on a étudié, mais potentiellement généralisable à l’échelle du génome.

L’ensemble de ces travaux contribue à faire avancer notre compréhension de la signalisation auxinique en contexte développemental, et plus généralement de la temporalité de la communication cellulaire, un processus encore méconnu chez les plantes.

Temporal integration of auxin information at the shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana: characterization at the cellular & genomic scales

The shoot apical meristem (SAM) is a structure located at the top of the stem, responsible for the formation of all aerial organs of the plant during its life. It is composed of a group of stem cells surrounded by an organogenetic zone, in which future organs are rhythmically determined by periodic local accumulations of the phytohormone auxin. Recent pioneering work in the RDP laboratory has contributed to the characterization of auxin dynamics. Using a quantitative microscopy approach on living SAMs, it has been shown that at the tissue level, the relationship between auxin signaling and auxin response is complex and non-linear: SAM cells in the organogenetic zone do not directly trigger a transcriptional response to auxin when exposed to it, but respond with a delay of about 12 hours. Continuous exposure to auxin for several hours is also necessary to trigger a transcriptional response. This suggests that the processing of the auxin signal by SAM cells involves a process of temporal integration, leading these cells not to respond to instantaneous auxin levels, but rather to sum their auxin exposure over time to generate a transcriptional response. The aim of this PhD work is to characterize more precisely this process of temporal integration, at the cellular and genomic scales.

At the cellular scale, we have pushed further the quantitative microscopy approach used to demonstrate temporal integration. Via long time-lapse confocal imaging on living SAMs, combined with a new cell tracking algorithm, we have been able to obtain meristematic cell trajectories for the first time, and quantify both auxin and transcriptional response dynamics along these trajectories, with excellent temporal resolution. The study of auxin transcriptional response with a synthetic reporter, DR5, and an endogenous reporter, AHP6 (ARABIDOPSIS HISTIDINE PHOSPHOTRANSFER 6), allowed us to characterize distinct auxin and transcriptional response trajectories, as well as their spatial organization across the SAM. By integral calculation methods, we were able to (1) reconstruct auxin integral maps at the SAM; (2) estimate key parameters associated with cellular processing of the auxin signal; (3) show that at certain developmental times, auxin integral is a better predictor of the transcriptional response than instantaneous auxin; and (4) decipher the integral/response relationship at the entrance of the organogenetic zone, as well as in future organs at early stages of development.

At the genomic scale, a bulk RNA-seq approach on SAMs treated with auxin for different durations allowed us to analyze the time-dependency of the expression of auxin target genes, as well as the global temporal dynamics of the transcriptomic response to auxin exposure. By cross-referencing these bulk RNA-seq data with ChIP-seq data on MONOPTEROS – a central transcription factor of the auxin signaling pathway in the SAM-, we were able to characterize different classes of direct auxin target genes. Some of these genes are sensitive to 2 hours of auxin exposure, while others require longer exposure durations to be regulated. This suggests that the temporal integration of auxin information is not a mechanism restricted to the reporters that we studied, but potentially generalized at the genome level.

All of this work contributes to advancing our understanding of auxin signaling in a developmental context, and more generally of the temporality of cellular communication, a process that is still poorly understood in plants.