Mécanismes multi-échelle de réparation de l’ADN par recombinaison homologue : rôle des boucles de chromatine

Résumé de la thèse

La recombinaison homologue (RH) répare les cassures de l’ADN en utilisant une molécule d’ADN intacte comme matrice. L’identification de cette molécule homologue (chromatide sœur, chromosome homologue ou répétition ectopique) nécessite sa rencontre avec le filament effectuant la recherche d’homologie. La RH permet la réparation des cassures double-brin (CDBs) accidentelles, ainsi que l’appariement des homologues pendant la méiose chez la plupart des eucaryotes. La RH a lieu dans un contexte de chromatine organisée en boucles par des extrudeurs de la famille SMC (Structural Maintenance of Chromosome) : la cohésine et la condensine. Au cours de sa thèse, Vinciane PIVETEAU s'est intéressée au rôle de la formation des boucles de chromatine par ces complexes SMCs dans la régulation de la RH chez S. cerevisiae.

Premièrement, nous avons étudié le rôle de la condensine dans le mating-type switch, un cas de RH programmée dans laquelle deux donneurs sont en compétition. Il a été prouvé que la condensine est impliquée dans la sélection de donneurs, par un mécanisme encore inconnu que nous avons souhaité élucider. L’analyse de l’augmentation de contacts entre le Recombination Enhancer (RE) et le reste du chr. III dans les cellules MATa révèle que la condensine extrude unidirectionnelle une boucle de ≈200 kb, avec des points d’arrêts reproductibles. La condensine est notamment bloquée à la CDB à MAT, formant une boucle rapprochant le donneur cible du filament. Cette association suffit à favoriser la formation de D-loops avec un donneur proche du RE. L’organisation du chr. III par la condensine favorise donc un donneur pendant le mating-type switch, via une régulation des contacts du filament par la formation d’une boucle dépendante de la CDB..  

La réparation de CDBs accidentelles se déroule dans un contexte de boucles de chromatine de 10-20 kb formées par la cohésine. La CDB bloque l’extrusion de la cohésine, positionnant le filament à la base des boucles. Vinciane PIVETEAU a étudié l’effet de l’organisation de la chromatine par la cohésine, et sa régulation par Pds5 et Rad61WAPL sur la RH. La cohésine favorise et limite la recherche d’homologie aux boucles flanquant la cassure. Cette organisation, qui isole les répétitions dans des boucles différentes, devrait inhiber les réarrangements entre répétitions en cis. Des expériences d’accumulation de mutations dans différentes conditions révèlent une augmentation du nombre et de la taille des réarrangements entre séquences répétées dans le mutant rad61Δ. La cohésine régule donc la visibilité du génome par le filament, la limitant aux boucles avoisinantes. La limitation de la taille des boucles de cohésine assure la stabilité génomique en inhibant la recombinaison entre répétitions en cis.

Enfin, la mutation de cohésine et de ses régulateurs présente des défauts de RH en méiose. Nous avons cherché à décrire le rôle de l’organisation des chromosomes en axe-boucle dans la régulation de la RH méiotique. Pour cela, Vinciane PIVETEAU a contribué au développement d’un système expérimental pour suivre simultanément l’organisation des chromosomes, leur appariement, et différentes étapes de la RH. La modification d’une base de boucle, sur un ou deux des homologues, révèle que l’appariement a lieu à la base des boucles, indépendamment des séquences avoisinantes. L’étude des intermédiaires de recherche suggère que la recherche d’homologie est conduite au niveau de l’axe. L’altération locale de la taille de boucle n’affecte pas la formation de crossovers inter-homologues, indiquant que la structure précise en boucles ne régule par la RH méiotique. L’axe apparaît plutôt comme la structure déterminante dans la régulation de la RH méiotique, de la formation de CDBs à l’identification d’homologie.

En conclusion, cette thèse contribue à l’établissement et la généralisation de l’idée selon laquelle la recherche d’homologie est finement régulée par les complexes SMC.

Multi-scale mechanisms of DNA repair by homologous recombination: role of chromatin loops

Homologous recombination (HR) is a conserved DNA double-strand breaks (DSBs) repair pathway that uses an intact homologous DNA molecule as a template. Donor identification, (be it the sister chromatid, a homologous chromosome, or ectopic repeats) requires its spatial encounter with the homology-searching filament. HR mends accidental DSBs in somatic cells, and drives homolog pairing in meiosis in most eukaryotes. In both cases, HR takes place in a chromosomal context in which chromatin is dynamically organized into loops by extruders of the Structural Maintenance of Chromosome family: cohesin and condensin. How the loop-forming activity of these complexes impinge on the search process remains ill-defined. During her thesis, Vinciane PIVETEAU investigated the role of the loop-forming activity of cohesin and condensin in regulating HR in various contexts in S. cerevisiae.

First, she investigated the role of condensin in mating-type (MAT) switching, a programmed HR-dependent process taking place on chr. III using one out of two competing donors. Condensin had been implicated in donor selection during MATa-to-alpha switching, and she sought to determine the underlying mechanism. Analysis of a condensin-dependent Hi-C stripe signal provided evidence that condensin unidirectionally extrudes ≈200 kb-long loops in cells and identified several roadblocks. Notably, DSBs block condensin. In the context of MAT switching, this block results in a well-defined loop that brings the DSB in contact with the target donor. This association is sufficient to promote D-loop formation at this proximal donor. Hence, condensin biases donor choice during MAT switching by targeting homology search towards a specific donor through the formation of a DSB-dependent loop.

Accidental DSB repair by HR takes place in the context of mitotic chromosomes in which cohesin forms 10-20 kb-long loops. The DSB creates a roadblock for cohesin loop extrusion, placing the broken region at the base of the loops. We questioned whether this cohesin-mediated loop organization controls filament-dsDNA contacts, and how cohesin dysregulation would affect homology search. By harnessing mutants of cohesin and its negative regulators Pds5 and Rad61/WAPL that limit loop length, we show that cohesin promotes and constrains homology search within the loops flanking the DSB, in a side-specific manner. This organization, which insulates repeated elements in different loops, is expected to inhibit ectopic recombination in cis. Mutation accumulation experiments indeed revealed that Rad61-deficient cells exhibited elevated and longer repeat-mediated rearrangements in cis. Cohesin regulates the visibility of the genome by the filament, focusing homology search in the immediate loops. Cohesin regulators that restrict loop span promote genome maintenance by inhibiting ectopic recombination between repeats in cis.

Finally, mutants of cohesin and its regulators exhibit profound HR defects in meiosis. We sought to carefully address the role of the loop-axis organization of prophase I chromosomes in regulating meiotic HR. To do so, I exploited an experimental system to jointly track chromosome organisation, homolog pairing, and key recombination steps over a 150 kb region on chr. IV. Repositioning of a single loop base, either on a single or on both homologs, revealed that pairing takes place at the base of chromatin loops, irrespective of the surrounding sequence. Tracking of search intermediates suggested that homology search was conducted at the level of the axis, in a Dmc1-independent manner. Intriguingly, local loop length alteration did not affect inter-homolog CO formation, indicating that the fine loop structure does not regulate meiotic HR. Instead, it points at the axis as the relevant structure regulating HR in meiosis, from DSB formation to homology identification.

Overall, this PhD work contributed to establish a general framework in which homology search is tightly regulated by SMC complexes.