Plasticité du pore nucléaire étudiée par microscopie à force atomique : effet du cycle circadien et interaction avec des capsides virales

Résumé de la thèse

Le passage à travers le pore nucléaire (NPC) permet le transport sélectif et directionnel des protéines et des ARNs entre le noyau et le cytoplasme des cellules, et joue donc un rôle critique dans la régulation de l'expression des gènes. Il présente une architecture cylindrique autour d'un canal central rempli de protéines hydrophobes non structurées.

Plusieurs techniques, telles que la cryomicroscopie électronique, la Microscopie à Force Atomique (AFM) ou la super-résolution optique ont été utilisées avec succès ces dernières années pour visualiser et caractériser les pores de l’enveloppe nucléaire. Ces études ont montré que le pore nucléaire est capable d'adapter sa structure globale à l'état de la cellule et qu'elle présente une plasticité structurelle et mécanique dans différents contextes. De plus, il a été mis en évidence que la présence du réseau de protéines hydrophobes dans le canal central du NPC constitue une barrière énergétique pour le passage au travers du pore et donc vers le noyau.

Dans ce travail, nous avons proposé une nouvelle méthode basée sur l'imagerie AFM de noyaux intacts purifiés de lignées cellulaires primaires d'hépatocytes de souris. Ainsi, nous pouvons mesurer précisément et de manière statistique le diamètre interne des pores, ce qui nous permet de quantifier la plasticité intrinsèque des NPCs. Nous avons également cartographié les propriétés mécaniques des pores par nano-indentation AFM et montré que son anneau est deux fois plus rigide que son canal central.

Nous avons utilisé cette approche pour sonder la plasticité induite des pores nucléaires dans deux contextes différents. Nous avons tout d’abord étudié l'effet d'un rythme biologique naturel, l'horloge circadienne. Ce rythme endogène régule divers processus biologiques au cours de la journée. Nous avons montré, en particulier, que le diamètre interne du NPC varie au cours du cycle circadien. Nous avons pu établir des corrélations entre cette plasticité induite par l’horloge et d'autres quantités mesurées, telles que la taille du noyau ou la densité des pores présents sur l'enveloppe nucléaire. Nos résultats révèlent des variations significatives de la taille des pores en fonction du moment de la journée, suggérant une modulation cyclique de leur architecture et de leur environnement nucléaire.

Par ailleurs, nous nous sommes intéressés à l'interaction de capsides virales avec ces pores biologiques, qui représentent les portes d'entrée du noyau cellulaire pour certains virus. Nous nous sommes focalisés sur deux capsides virales : celle du Virus Adéno-Associé (AAV) de seulement 25 nm de diamètre, non pathogène et qui est utilisé comme vecteur de transfert de gènes dans les applications de thérapie génique, et celle du Virus de l'Hépatite B (HBV), un pathogène humain majeur dont la capside mesure 32 nm. Ces deux capsides sont de symétrie icosahédrique, de taille similaire mais leur rigidité est très différente. Dans des conditions d’imagerie AFM dans l’air, nous avons observé une modification de la distribution de taille des NPCs après interaction avec les capsides virales : le diamètre moyen du pore est légèrement réduit après interaction avec les capsides HBV alors qu’il est significativement agrandi après le passage des capsides AAV. Ces résultats préliminaires suggèrent des modes de transport à travers la membrane nucléaire différents et ouvrent de nombreuses perspectives pour mieux comprendre comment les propriétés mécaniques des capsides virales modulent l'interaction et le passage à travers les pores nucléaires.

En résumé, ce travail expérimental à l’échelle du pore individuel permet de mettre en avant la plasticité intrinsèque et induite du NPC, dans 2 contextes physiologiques différents. Elle démontre le rôle important de la variabilité structurale et dynamique du pore nucléaire pour comprendre son fonctionnement et ses mécanismes.

Nuclear pore complex plasticity studied by atomic force microscopy: effect of the circadian cycle and interaction with viral capsids

Transport through the Nuclear Pore Complex (NPC) enables the selective and directional trafficking of proteins and RNAs between the nucleus and the cytoplasm of cells and thus plays a critical role in the regulation of gene expression. The NPC displays a cylindrical architecture surrounding a central channel filled with unstructured hydrophobic proteins.

Recently, several techniques, such as cryo-electron microscopy, Atomic Force Microscopy (AFM), or super-resolution fluorescence microscopy, have been successfully used to visualize and characterize nuclear envelope pores. These studies have shown that the nuclear pore complex can adapt its overall structure to the state of the cell and that it exhibits both structural and mechanical plasticity in various contexts. In addition, the presence of a of a hydrophobic protein network within the central channel of the NPC has been shown to constitute an energetic barrier for translocation through the pore and thus into the nucleus.

In this work, we proposed a new method based on AFM imaging of intact nuclei purified from primary mouse hepatocyte cell lines. This approach enables us to precisely and statistically measure the internal diameter of nuclear pore complexes, allowing us to quantify the intrinsic plasticity of NPCs. We also mapped the mechanical properties of the pores using AFM-nano-mechanics and showed that the pore ring is twice as rigid as its central channel.

We used this approach to probe the induced plasticity of nuclear pore complexes in two different physiological contexts. First, we investigated the effect of a natural biological rhythm: the circadian clock. This endogenous rhythm regulates various biological processes over the course of the day. We showed, in particular, that the internal diameter of the NPC varies throughout the circadian cycle. In addition, we were able to establish correlations between this clock-induced plasticity and other measured parameters, such as nuclear size or the pore density on the nuclear envelope. Our results reveal significant variations in pore size depending on the time of day, suggesting a cyclic modulation of their architecture and of the nuclear environment.

In parallel, we examined the interaction of viral capsids with these biological pores, which serve as gateways to the cell nucleus for certain viruses. We focused on two viral capsids: the one of the Adeno-Associated Virus (AAV), only 25 nm in diameter, a non-pathogenic virus widely used as a vector for gene therapy, and the one of the Hepatitis B Virus (HBV), a major human pathogen with a capsid size of 32 nm. These two capsids exhibit icosahedral symmetry and a similar diameter, but their stiffness is very different. Under AFM imaging conditions in air, we observed a shift in the NPC size distribution following interaction with viral capsids: the average pore diameter was slightly reduced after interaction with HBV capsids, whereas it was significantly increased after the passage of AAV capsids. These preliminary results suggest distinct transport mechanisms across the nuclear membrane and open new perspectives in the understanding how the mechanical properties of viral capsids modulate their interaction with and through the nuclear pore complexes.

In summary, this experimental work at the single pore level highlights both the intrinsic and induced plasticity of the NPC in two distinct physiological contexts. It demonstrates the important role of the structural and dynamical variability of the nuclear pore complex in understanding its function and mechanisms.