Régulation de la voie de l'inflammasome NLRP3 par la phosphatase PPM1A

Résumé de la thèse

Les agents pathogènes et les lésions tissulaires sont rapidement détectés grâce à l'activation de récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR), qui déclenchent des réponses protectrices. NLRP3 est un PRR protecteur contre des agents infectieux très divers, notamment les virus, les bactéries, les champignons et les parasites. D'autre part, une activation inappropriée de NLRP3 provoque une inflammation héréditaire, participe à des tempêtes cytokiniques lors d'infections et contribue à de nombreuses maladies multifactorielles, notamment l'arthrite goutteuse, l'athérosclérose, le diabète, les troubles neurodégénératifs et les lésions d'ischémie-reperfusion. Suite à son activation, NLRP3 assemble un complexe de signalisation nommé inflammasome servant de plateforme d'activation pour la protéase caspase-1. La caspase-1 contrôle la maturation et la sécrétion des principales cytokines inflammatoires, IL-1β et IL-18, produites sous forme de précurseurs dans le cytosol, et déclenche la mort cellulaire inflammatoire par pyroptose.

Dans les macrophages, l'assemblage de l'inflammasome NLRP3 nécessite des signaux coordonnés de priming, généralement fournis par des PRR membranaires (notamment le récepteur TLR4 qui reconnaît le lipopolysaccharide à la surface des bactéries), suivis de signaux d'activation fournis par divers stress cellulaires. La voie de l'inflammasome est régulée à la fois au niveau transcriptionnel, Nlrp3 et Il1b étant induit par la voie NF-κB, et par des modifications post-traductionnelles de NLRP3 et des composants de l'inflammasome. En particulier, notre équipe a décrit précédemment que NLRP3 était phosphorylé sur le serine 806 par CSNK1A1 durant le priming, mais que sa déphosphorylation suite au signal d’activation est requise pour l’assemblage de l’inflammasome. Par crible siRNA, la sérine/thréonine phosphatase PPM1A a été identifié comme un régulateur positif de NLRP3. L’objectif de mon projet de thèse était de caractériser la régulation de l’inflammasome NLRP3 par PPM1A.

Nous avons généré des souris déficientes pour Ppm1A par transgenèse utilisant l’approche Crispr/CAS9. Les macrophages primaires issus de moelle osseuse (BMDM) de souris Ppm1a-/- présentent une réduction de la pyroptose en réponse aux agonistes de NLRP3 indépendamment de la nature des signaux de priming ou d’activation. Au contraire, les BMDM Ppm1a-/- présentent une sécrétion d’IL-1β inchangée, ou même augmentée, en réponse à ces mêmes agonistes de NLRP3. NLRP3 et PPM1A interagissent physiquement, comme montré par co-immunoprécipitation, et PPM1A déphosphoryle NLRP3 lors de leur co-expression en cellules 293T. In vitro, la protéine recombinante PPM1A déphosphoryle le peptide phosphorylé correspondant à la sérine 806 de NLRP3. Ces résultats suggèrent que PPM1A pourrait être la phosphatase responsable de la déphosphorylation de NLRP3 sur la sérine 806, obligatoire pour le recrutement des autres composants de l’inflammasome. Indépendamment de son interaction directe avec NLRP3, PPM1A réprime la voie NF-kB. En effet, suite aux signaux de priming, l’expression des ARNm de Nlrp3 et Il1b, de même que les niveaux protéiques de NLRP3 et pro-IL-1β sont fortement augmentés dans les macrophages Ppm1a-/- comparé au WT. Ensemble, ces résultats indiquent que PPM1A régule la voie NLRP3 par deux mécanismes distincts et antagonistes. D’une part PPM1A réprime le priming transcriptionel de NLRP3, alors que d’autre part il catalyse la déphosphorylation de NLRP3 indispensable à l’assemblage de l’inflammasome lors de l’étape d’activation. Ainsi, ce travail identifie les mécanismes de la régulation de l’inflammasome NLRP3 par la phosphatase PPM1A, une nouvelle cible pouvant être ciblée par des drogues pour inhiber l’inflammation dépendante de NLRP3.

Regulation of the NLRP3 pathway by the PPM1A phosphatase

Pathogens and tissue damage are rapidly detected by the activation of host pattern recognition receptors (PRRs) that trigger protective responses. NLRP3 is a protective PRR against highly diverse infectious agents including viruses, bacteria, fungi and parasites. On the other side, inappropriate activation of NLRP3 causes hereditary inflammation, participates in detrimental cytokine storms upon infections, and contributes to numerous multifactorial diseases including gouty arthritis, atherosclerosis, diabetes, neurodegenerative disorders and ischemia-reperfusion insults. Upon activation, NLRP3 assembles an inflammasome signalling complex serving as an activation platform for caspase-1. Caspase-1 controls the maturation and the secretion of major inflammatory cytokines IL-1β and IL-18 produced as precursor in the cytosol, and triggers pyroptosis inflammatory cell death.

In macrophages, NLRP3 inflammasome assembly requires coordinated priming signals, usually provided by membrane PRRs (including the receptor TLR4 which recognizes the lipopolysaccharide at the surface of bacteria), followed by activation signals provided by various cell stress. The inflammasome pathway is regulated both at the transcriptional level, with Nlrp3 and Il1b being upregulated downstream of the NF-kB pathway, and by post-translational modifications of NLRP3 and inflammasome components. In particular, our team previously described that NLRP3 is phosphorylated at Serine 806 by CSNK1A1 during priming, but that its dephosphorylation is mandatory for the inflammasome assembly upon activation signal. By siRNA screen, the serine/threonine phosphatase PPM1A was identified as a positive regulator of NLRP3. The objective of my PhD project was to characterize the regulation of NLRP3 inflammasome by PPM1A.

We generated mice deficient for Ppm1a by Crispr/CAS9-based transgenesis. Ppm1a-/- primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) show decreased pyroptosis in response to NLRP3 agonists independently of the nature of the priming or activation signals. In contrast, Ppm1a-/- BMDMs show similar or increased secretion of IL-1β downstream of the same NLRP3 agonists. NLRP3 and PPM1A interact directly as shown by co-immunoprecipitation, and PPM1A dephosphorylates NLRP3 upon co-expression in 293T cells. By in vitro dephosphorylation assay, we show that recombinant PPM1A dephosphorylates the phospho-peptide corresponding to NLRP3 S806. These results suggest that PPM1A may be the phosphatase responsible for the dephosphorylation of NLRP3 at S806 mandatory for recruitment of other inflammasome components. Independently of its direct interaction with NLRP3, PPM1A repress the NF-kB pathway. Indeed, expression of Nlrp3 and Il1b mRNA, as well as NLRP3 and pro- IL-1β protein levels were strongly increased in primed Ppm1a-/- as compared to WT BMDMs. Altogether, these results support that PPM1A regulate the NLRP3 pathway thought two distinct and antagonist mechanisms. PPM1A repress NLRP3 transcriptional priming, but catalyzes NLRP3 dephosphorylation mandatory for inflammasome assembly during the activation step. Thus, this work identified the mechanisms underneath NLRP3 inflammasome regulation by the PPM1A phosphatase, a new druggable targets to inhibit NLRP3-dependent inflammation.