Une approche à plusieurs niveaux du transcriptome circadien et de l'impact des perturbations du rythme circadien

Résumé de la thèse

L’horloge circadienne endogène est un système intrinsèque de mesure du temps qui génère des rythmes d’environ 24 heures dans les processus cellulaires, physiologiques et comportementaux. Régulée par des boucles de rétroaction moléculaires, elle coordonne les fonctions biologiques avec les fluctuations environnementales quotidiennes, optimisant leur synchronisation et permettant aux organismes de les anticiper et de s’y adapter. Les composants centraux de l’horloge régulent l’accessibilité de la chromatine, la transcription génique, l’abondance des protéines et les modifications post-traductionnelles, assurant le contrôle temporel des fonctions cellulaires. La perturbation circadienne, d’origine externe ou interne, est associée à de nombreux troubles métaboliques, neurologiques et psychologiques.

La régulation post-transcriptionnelle constitue un niveau essentiel du contrôle de l’expression génique au-delà de la transcription. Toutefois, le rôle de l’horloge circadienne dans la coordination des processus post-transcriptionnels et leur contribution à la diversité temporelle du transcriptome restent mal compris. Dans cette thèse, j’ai étudié deux mécanismes de régulation co-/post-transcriptionnelle — l’épissage alternatif et les modifications de l’ARN (N6-méthyladénosine, m6A) — afin d’explorer leurs interactions avec l’horloge circadienne chez des souris de type sauvage et des souris doubles invalidées pour Per1/Per2 (PerKO). Ce travail repose sur le séquençage direct de l’ARN (DRS) couplé à des analyses bioinformatiques, permettant de caractériser simultanément l’expression des transcrits, l’épissage alternatif et les modifications de l’ARN à l’échelle de la molécule unique.

Nous avons réalisé un DRS Oxford Nanopore Technologies (ONT) sur des foies de souris prélevés à six temps circadiens ainsi que chez des animaux PerKO. Cette approche a permis d’élargir le transcriptome hépatique murin par la caractérisation de l’expression des isoformes à partir de lectures longues, d’étudier leur cyclicité, révélant des phases et amplitudes spécifiques, et de caractériser la dynamique circadienne de l’épissage alternatif ainsi que sa dérégulation chez les souris PerKO. L’intégration avec des données de protéomique quantitative a identifié un mécanisme dépendant de la chromatine par lequel l’horloge circadienne régule les programmes d’épissage alternatif.

Grâce à la chimie ONT RNA004 pour la détection *de novo* de la m6A, nous avons établi une cartographie transcriptomique de la méthylation de l’ARN dans le foie murin. La comparaison d’échantillons diurnes, nocturnes et PerKO a permis d’identifier plus de 13 000 sites de m6A, validant de nombreux sites précédemment rapportés sans confirmation orthogonale et élargissant le catalogue des sites m6A à résolution nucléotidique. Les transcrits rythmiques étaient enrichis en sites m6A, dont l’abondance suivait globalement leur expression, tandis que la fraction de transcrits modifiés par gène restait stable au cours du temps, y compris chez les souris PerKO malgré une dérégulation transcriptionnelle. Un sous-ensemble de sites présentait toutefois des niveaux de modification différentiels indépendants de l’expression, révélant de potentielles conséquences épitranscriptomiques de la perturbation circadienne et fournissant des sites candidats pour de futures études mécanistiques.

Dans son ensemble, ce travail approfondit notre compréhension de la régulation circadienne et de sa perturbation en offrant une vision multicouche du transcriptome à l’échelle de la molécule unique, intégrant l’expression des isoformes, l’épissage alternatif et les modifications de l’ARN. Les jeux de données et pipelines bioinformatiques générés constituent une ressource pour l’étude de la diversité du transcriptome et de sa régulation par les processus post-transcriptionnels, y compris d’autres modifications de l’ARN telles que la pseudouridine, dans des contextes physiologiques et de perturbation circadienne.

A Multi-Layered View of the Circadian Transcriptome and the Impact of Circadian Disruption

The endogenous circadian clock is an intrinsic timekeeping system that drives ~24-hour rhythms in cellular, physiological, and behavioural processes. Regulated by molecular feedback loops, it coordinates biological functions with daily environmental fluctuations, optimizing physiological timing and enabling organisms to anticipate and adapt to these changes. Core clock components regulate chromatin accessibility, gene transcription, protein abundance, and post-translational modifications, thereby orchestrating temporal control of cellular function. Circadian disruption, caused by external or internal factors, has widespread detrimental health effects and is associated with numerous metabolic, neurological, and psychological disorders

Post-transcriptional regulation represents an additional critical layer of gene expression control beyond transcription. However, the role of the circadian clock in coordinating post-transcriptional processes and their contribution to temporal transcriptome diversity remains poorly understood. In this thesis, I investigated two co-/post-transcriptional regulatory mechanisms—alternative splicing and RNA modifications (N6-methyladenosine, m6A)—to explore their interplay with the circadian clock in wild-type mice and under circadian disruption using Per1/Per2 double-knockout (PerKO) mice. This work primarily leveraged direct RNA sequencing (DRS) coupled with bioinformatic analyses, enabling simultaneous characterization of transcript expression, alternative splicing, and RNA modifications at single-molecule resolution.

First, we performed Oxford Nanopore Technologies (ONT) DRS on mouse livers collected across six circadian time points as well as from PerKO animals. It allowed us to a) expand the mouse liver transcriptome by characterizing long-read-based isoform-level expression; b) investigate transcript cyclicity at the isoform level, revealing isoform-specific phases and amplitudes of expression; and c) characterize circadian dynamics of alternative splicing events and their misregulation in PerKO mice. By integrating these results with quantitative proteomics, we identified chromatin targeting of a splicing factor as a potential molecular mechanism through which the circadian clock regulates alternative splicing programs.

Next, using the improved ONT RNA004 chemistry for de novo m6A detection while avoiding biases associated with short-read sequencing, we generated a transcriptome-wide map of RNA methylation in mouse liver. Comparing day, night, and PerKO samples identified over 13,000 m6A sites, validating many previously reported sites lacking orthogonal confirmation while substantially expanding the catalog of single base m6A sites in mouse liver. This allowed us to explore the relationship between circadian gene expression and m6A deposition. Rhythmic transcripts were enriched for m6A sites, and modification abundance broadly followed transcript expression, whereas the fraction of modified transcripts per gene remained stable over time. This pattern was largely preserved in PerKO mice despite transcriptional misregulation, although a subset of sites displayed differential modification independent of expression, revealing potential downstream epitranscriptomic consequences of PER deficiency while providing candidate sites for future mechanistic studies for circadian genes.

Overall, this work advances our understanding of circadian regulation and its disruption by providing a single-molecule, multi-layered view of the transcriptome, encompassing isoform expression, alternative splicing, and RNA modifications. In addition, the datasets and bioinformatic pipelines generated constitute a valuable community resource for investigating transcriptome diversity and its regulation by post-transcriptional processes, including additional RNA modifications such as pseudouridine, in both normal and disrupted circadian contexts.