Le système CRISPR-Cas9 permet une modification ciblée du génome via une cassure double brin induisant des insertions ou délétions au locus cible. En revanche, le Prime Editing permet une réécriture précise du génome sans créer de cassure double brin, limitant ainsi les effets indésirables. Ce système repose sur une Cas9 nickase fusionnée à une rétrotranscriptase et un prime editor guide RNA (pegARN ), qui combine à la fois la séquence de ciblage et de réécriture. Le prime editor et son guide ARN permettent d’introduire des mutations ponctuelles, des insertions ou des délétions avec une grande précision. Après modification, la réparation de l’ADN instaure soit la mutation désirée, soit un retour à la séquence initiale. Le Prime Editing est donc moins toxique et plus précis que CRISPR-Cas9, bien que son efficacité soit réduite. Sachant qu’environ 90 % des variants pathogènes répertoriés dans la base de données ClinVar sont des mutations ponctuelles, cela fait du Prime Editing une technologie de choix pour des applications en thérapie génique. Une question clé avant toute application ex-vivo ou in-vivo est la méthode de livraison des outils de thérapie génique. L’utilisation de particules pseudo-virales dérivées de rétrovirus pour la livraison de complexes ribonucléoprotéiques s’est largement démocratisée dans la dernière décennie, car elles permettent une édition rapide tout en réduisant les effets hors-cibles. Dans le cas des ribonucléoprotéines, la livraison repose majoritairement sur la fusion de la protéine d’intérêt à la protéine virale GAG ou sur la capture active du guide ARN, qui transporte alors la Cas9.
Dans cette thèse, nous avons développé une méthode de livraison du prime editor et de son pegARN sous forme de complexe ribonucléoprotéique via des particules pseudo-virales basées sur le virus de la leucémie murine. Pour cela, le variant prime editor 2 ou PEmax a été fusionné à la protéine GAG ainsi qu’à des séquences d’export nucléaire. Parallèlement, les pegARNs ont été stabilisés par l’ajout de la tige-boucle TAR du VIH-1 ainsi qu’un pseudonœud. Ces évolutions moléculaires ont permis d’atteindre des taux d’édition endogène compétitifs par rapport à ceux obtenus via une transfection classique. Cependant, le variant PEmax permet d’obtenir de meilleurs taux d’édition. Ensuite, l’encodage des pegARNs a été modifié pour être dépendant de la polymérase II grâce à des stratégies d’encodage intronique du guide. Ce qui a permis d’obtenir les meilleurs taux d’édition via la livraison avec les NanoScribes. Nous avons ensuite démontré que la livraison du complexe PEmax/pegARN par les NanoScribes est plus sécurisée que la transfection de matériel génétique codant ces éléments. Enfin, les NanoScribes permettent l’édition de cellules d’intérêt thérapeutique telles que les hiPSCs avec des taux satisfaisant sans contrevenir à la capacité de ces cellules à se différencier en motoneurones.
English version
Design of Pseudo-retroviral Particles Delivering the Prime Editing Ribonucleoprotein Complex
The CRISPR-Cas9 system enables targeted genome modification by inducing double-strand breaks, which lead to insertions or deletions at the target locus. In contrast, Prime Editing allows for precise genome rewriting without creating double-strand breaks, thereby minimizing off-target effects. This system relies on a Cas9 nickase fused to a reverse transcriptase and a prime editor guide RNA (pegRNA), which combines both the targeting sequence and the rewriting template. The prime editor and its guide RNA facilitate the introduction of point mutations, insertions, or deletions with high precision. After the modification, DNA repair either introduces the desired mutation or restores the original sequence. Prime Editing is, therefore, less toxic and more precise than CRISPR-Cas9, although its overall efficiency is somewhat lower. Since approximately 90% of pathogenic variants listed in the ClinVar database are point mutations, Prime Editing stands out as a key technology for gene therapy applications. One critical consideration before any ex-vivo or in-vivo application is the delivery method for gene therapy tools. Over the past decade, the use of retrovirus-like particles for delivering ribonucleoprotein complexes has become widely adopted, as these particles enable rapid gene editing while reducing off-target effects. In the case of ribonucleoproteins, delivery primarily depends on the fusion of the protein of interest to the viral GAG protein or active capture of the guide RNA, which then carries the Cas9 protein.
In this thesis, we developed a method for delivering the prime editor and its pegRNA in the form of ribonucleoprotein complexes via virus-like particles based on the murine leukemia virus. For this purpose, the prime editor 2 or PEmax variant was fused to the GAG protein and nuclear export sequences. Simultaneously, the pegRNAs were stabilized by adding the TAR stem-loop from HIV-1 and a pseudoknot. These molecular optimizations achieved editing rates comparable to those obtained through conventional transfection methods. Moreover, the PEmax variant demonstrated higher editing efficiency. Additionally, pegRNA encoding was modified to be dependent on RNA polymerase II using intronic encoding strategies, leading to the highest editing rates observed through NanoScribes delivery. We further demonstrated that delivering the PEmax/pegRNA complex via NanoScribes is safer than transfecting genetic material encoding these elements. Finally, NanoScribes enabled the editing of therapeutically relevant cells, such as hiPSCs, with satisfactory editing rates without impairing their ability to differentiate into motor neurons.
Gratuit
Disciplines