LA PCR quantitative

Déroulement de la formation

• 3 jours (21 heures)

Contenu de la formation

Aspect Théorique 

• Mesure du signal d’amplification par fluorescence  
• Analyse de la courbe de dissociation (Melting Curve Analysis)
• Étude de la cinétique d’amplification
• Efficacité de la PCR 
• Quantification par PCR en temps réel 
• Stratégie de normalisation
• Les résultats
• Publication et PCRQ : les MIQUE
• Validation des microarray et PCRQ haut débit
• Différentes approches du génotypage ou polymorphisme en PCRQ  
• Dessin des amorces de PCRQ  
• Stratégie efficace de design 

Aspect pratique

• Précautions et risques biologiques
• Mise en place d’un projet de quantification : les points à considérer
• Les équipements : thermocycleurs, circuit PCR, Nanodrop, bio analyseur
• Les consommables
• Les kits  
• Protocoles et optimisation  
• Échantillons, ARN, cDNA, ADN : nature, qualité, extraction, quantification, conservation
• La reverse transcription : une étape clé à optimiser en permanence  
• Le cDNA
• Détecter les inhibitions de la PCR  
• Les amorces
• La gamme d’étalonnage
• Les contaminations et cross contaminations

Partie pratique

• Présentation des équipements nécessaires leur bonne utilisation
• Circuit PCR, Nanodrop, Instrument de QPCR et éventuellement Robot pipetteur  
• Les bons gestes et les pièges à éviter  
• Se focaliser sur la programmation, l’analyse d’une manipulation et l’exploitation des résultats
• Présentation du logiciel du StepOne Plus
• Préparation et programmation de la manipulation et des runs  
• Réalisation de deux gammes d’étalonnage – Une série d’échantillons
• Analyse des runs
• Calcul et exploitation dans Excel  
• Présentation d’outils gratuits pour les calculs ou la normalisation : REST, Bestkeeper, Genorm
• Bibliographie