Étude de la fonction de LEUNIG-HOMOLOG et des facteurs de transcription à boite MADS dans les téguments de la graine d’Arabidopsis

Résumé de la thèse

Les graines des plantes à fleurs sont entourées de téguments dérivés des tissus maternels, qui protège l’embryon mature et influence la germination, la dormance, la dispersion et la longévité des graines. Ces fonctions dépendent en grande partie de la structure de ces téguments, et notamment de la présence de barrières apoplastiques qui limitent l’absorption de solutés et de gaz par la graine. Comprendre le contrôle génétique de ces propriétés est essentiel pour améliorer les caractéristiques des graines dans les programmes de sélection.

Cette thèse explore le rôle du corégulateur transcriptionnel LEUNIG_HOMOLOG (LUH) dans les téguments de la graine d’Arabidopsis thaliana. Des études antérieures ont montré que LUH régule la structure des pectines produites par les cellules de la couche du tégument externe n°2 (oi2). Ces pectines sont des composants majeurs du mucilage, une substance gélatineuse libérée par la graine en cours de germination au contact de l’eau, facilitant son hydratation et son adhésion au sol. Toutefois, puisque LUH pourrait être exprimé plus largement dans les téguments, il est probable qu’il remplisse aussi d’autres fonctions dans d’autres couches cellulaires.

La première partie de cette thèse a donc consisté à caractériser l’activité spatiotemporelle de LUH dans les téguments en développement. Ce travail a montré que LUH était actif dans toutes les couches des téguments, régulant positivement ou négativement de nombreux gènes, dont des régulateurs majeurs du développement comme les facteurs de transcription à boite MADS. Une analyse transcriptomique a aussi révélé des altérations dans les voies biosynthétiques des polyesters lipidiques tels que la subérine, la cutine et les cires chez les graines mutantes luh. Ces résultats ont conduit à étudier si les barrières apoplastiques formées par ces composés étaient affectées. Des analyses biochimiques ont confirmé une réduction des monomères aliphatiques et aromatiques, ainsi qu’un raccourcissement des chaînes d’acides gras dans les graines mutantes. Des tests de perméabilité ont montré une barrière compromise, ce qui a été confirmé par microscopie, et a révélé la présence d’anomalies structurelles dans les barrières apoplastiques externes comme internes des téguments. Enfin, des expériences génétiques ont montré une atteinte plus marquée de la barrière interne que de la barrière externe chez les graines du mutant luh.

Dans la dernière partie de cette thèse, les relations entre SEPALATA3 (SEP3) et LUH ont été explorées. SEP3 forme un complexe avec la protéine LEUNIG dans les fleurs, et les graines du mutant sep3 présentent un défaut de perméabilité. Cependant, des analyses génétiques, moléculaires et microscopiques suggèrent que SEP3 et LUH agissent séparément : SEP3 affecte la barrière oi1, tandis que LUH influence principalement la barrière associée à l’endothélium. Ce chapitre de la thèse décrit aussi un protocole permettant d’effectuer des transformations génétiques ciblées dans des couches spécifiques du tégument, une approche permettant d’étudier l’activité de gènes comme AGAMOUS, essentiel à la formation des graines.

En conclusion, cette étude met en lumière le rôle de LUH dans le maintien de l’intégrité de la barrière apoplastique du tégument interne de la graine. Bien que les mécanismes précis restent à élucider, les résultats de ce travail supportent que LUH pourrait activer l’expression gènes impliqués dans la formation des polyesters lipidiques dans cette couche cellulaire.

Investigating the function of LEUNIG-HOMOLOG and MADS-box transcription factors in the seed coat of Arabidopsis

Seeds of flowering plants are surrounded by a maternally derived seed coat that confers physical protection to the mature embryo, as well as influencing factors such as timing of germination, length of dormancy, seed dispersal and seed longevity. Many of these functions depend on the structure of the seed coat, particularly apoplastic permeability barriers that limit uptake of solutes and gases into the seed. Understanding how these seed coat properties are genetically controlled is necessary for crop improvement programs aimed at optimizing seed characteristics.

This thesis describes work investigating the role of the transcriptional coregulator LEUNIG_HOMOLOG (LUH) in the Arabidopsis thaliana seed coat. Previous genetic and biochemical studies identified a role for LUH in regulating the modification of pectins produced by the outer integument 2 (oi2) cells of the seed coat. These compounds are key components of mucilage, a gel-like substance that is released from seeds following exposure to water and which enhances seed hydration dynamics and soil adhesion during germination. As previous studies indicate that LUH might be expressed more broadly in the seed coat suggests, it is likely that this gene has additional functions.

In the first part of this study, the spatiotemporal activity of LUH in the developing Arabidopsis seed coat was characterized. This analysis confirmed that LUH is active in all layers of the seed coat, where it functions as a positive or negative regulator of many genes including important plant developmental regulators such as the MADS-box transcription factor.

Analysis of transcriptomic data obtained from luh mutant seeds revealed disruptions in the lipid polyester biosynthetic pathways that produce suberin, cutin and waxes. The possibility that the seed coat apoplastic barriers derived from lipid polyesters were disrupted in luh mutant seeds was investigated in the second part of this study. Biochemical analysis confirmed alterations in lipid polyester content of luh mutant seeds, which were associated with decreases in both aliphatic and aromatic monomers associated with suberin and cutin as well as a reduction the chain length of fatty acids. Furthermore, assays performed on mutant seeds revealed increased permeability, suggesting that the integrity of the seed coat barriers might be compromised. This was subsequently confirmed through microscopy which revealed alterations in the cellular structure of both outer and inner apoplastic barriers of luh mutant seeds. Finally, genetic and plant transformation experiments identified the inner seed coat barrier as being most affected in luh mutants.

As SEPALLATA3 (SEP3) forms a functional complex with the LUH-like protein LEUNIG in developing flowers, and sep3 mutant seeds have a reported permeability defect, experiments performed in the last part of this study addressed whether SEP3 and LUH function together in the seed coat. Using a combination of genetic, molecular and microscopic approaches, the function of SEP3 and LUH appeared separable, with SEP3 regulating the integrity of the oi1 seed coat barrier and LUH predominantly regulating the endothelium-associated barrier. In addition to investigating SEP3 activity in the seed coat, this chapter also describes a series of plant transformation experiments to alter gene activity in specific layers of the seed coat. This approach enables the characterization of genes whose function in the seed coat cannot easily be assessed due to their requirement for seed formation and was applied to the study of the MADS TF AGAMOUS, which when mutated fails to produce seeds.

In summary, this study provides new insights into the function of the transcriptional coregulator LUH in the seed coat, by characterizing its role in regulating the integrity of the inner apoplastic barrier of the seed coat. Precisely how this occurs remains unclear but may involve LUH promoting genes associated with lipid polyester formation.