Identification des gènes cibles des récepteurs de l'hormone thyroïdienne : analyse in vitro et exploration in vivo dans l'hypothalamus de souris

Résumé de la thèse

Les hormones thyroïdiennes (HT, dont la thyroxine et la 3,3’,5-triiodo-L-thyronine, ou T3, son métabolite actif) sont essentielles tout au long de la vie. Elles régulent les processus de développement et maintiennent l’homéostasie systémique à l’âge adulte, exerçant leur action en se liant à des récepteurs nucléaires (TR, dont TRα1 et TRβ1), présents dans pratiquement tous les types cellulaires. Les TR forment des hétérodimères avec les récepteurs des rétinoïdes X (RXR) et se lient à l’ADN sur des éléments de réponse largement répandus dans le génome. La liaison des HT induit le remodelage de la chromatine et active la transcription des gènes voisins.

L’objectif principal de la thèse était de comprendre la fonction des HT dans l’hypothalamus de la souris adulte, une zone cérébrale qui joue un rôle central dans la régulation de l’équilibre énergétique. L’hypothalamus intègre des signaux hormonaux et neuronaux pour contrôler la température, l’appétit, les rythmes circadiens et la dépense énergétique, autant de fonctions physiologiques sensibles aux HT. Il régule également le taux circulants d’HT, via l'axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HPT).

Pour identifier les gènes cibles des TR dans les types cellulaires de l'hypothalamus, nous nous sommes concentrés sur deux critères : la présence de sites de liaison des TR dans les séquences régulatrices des gènes et l'expression des gènes sensibles à T3. Nous nous sommes appuyés sur un atlas des sites de liaison des TR identifiés dans divers tissus et types cellulaires, dont une fraction est commune à tous les types cellulaires. La première partie de la thèse décrit une analyse in vitro de ces éléments de réponse putatifs aux TR. Nous avons développé la méthode SOSHI-seq (Screening of self-transcribed hormone-inducible elements sequencing), un test rapporteur in vitro à haut débit qui consiste à placer des fragments d'ADN dans la partie transcrite d'un vecteur plasmidique. L'activité d'un fragment d'ADN lui permet de renforcer sa propre transcription de manière dépendante de T3. Le SOSHI-seq est donc une procédure générale permettant de tester la présence d'éléments fonctionnels sensibles à T3 dans des fragments d'ADN génomique. En criblant 2 000 fragments, nous avons identifié environ 500 éléments activés par T3, dont beaucoup contenaient des motifs DR4 canoniques (AGGTCANNNNAGGTCA). Les dosages de la luciférase ont confirmé et précisé les résultats du SOSHI-seq.

Pour profiler les gènes in vivo, nous avons traité des souris avec du propylthiouracile afin de réduire le niveau de TH. Nous avons ensuite traité les souris avec de la TH et réalisé un séquençage d'ARN nucléaire (snRNA-seq) sur l'hypothalamus médiobasal des souris, combiné à un séquençage par RNA-seq de différents types cellulaires triés. Nous avons identifié la réponse à T3 de 21 groupes cellulaires. Afin d'examiner les rôles physiologiques de la signalisation T3 dans l’hypothalamus, nous avons généré deux lignées de souris exprimant un TRα1 dominant-négatif afin de bloquer la signalisation T3 dans les astrocytes ou les oligodendrocytes. L’expression innattendue de la mutation dans le pancréas, a cependant empêché d’interprétation ces données.

En résumé, notre étude fournit une analyse multidimensionnelle de la signalisation des HT dans l'hypothalamus. Ces résultats apportent un nouvel éclairage sur les actions spécifiques des cellules T3 dans le cerveau et soulignent le rôle de l'hypothalamus dans la régulation du métabolisme.

Identification of thyroid hormone receptors target genes: in vitro analysis and in vivo exploration in mouse hypothalamus. 

Thyroid hormones (THs, including thyroxine and 3,3’,5-triiodo-L-thyronine, or T3, its active metabolite) are essential throughout life. They regulate developmental processes and maintain systemic homeostasis in adulthood, exerting their action by binding to nuclear receptors (TRs including TRα1 and TRβ1) which are present in virtually all cell types. Typically TRs form heterodimers with retinoid X receptors (RXRs) and bind DNA to response elements which are widespread in the genome. TH binding induces chromatin remodeling, and activates the transcription of neighboring genes. 

The overarching goal of the thesis was to understand the function of THs in adult mouse hypothalamus, a brain area that is a central regulator of energy balance. The hypothalamus integrates hormone and neural inputs to control temperature, appetite, circadian rhythms, and energy expenditure, all physiological functions, which are sensitive to TH. It also governs the level of circulating THs through the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis. The hypothalamus contains a number of neuronal and glial cell types, and understanding the influence of TH on each of these cell types is a daunting task. To identify TR target genes in hypothalamus cell types, we focused on two criteria: the presence of TR binding sites in gene regulatory sequences and T3-responsive gene expression. As ChIP-seq analysis is currently not feasible in the hypothalamus, we relied on an atlas of TR binding sites identified in a variety of tissues and cell types, a fraction of which being shared across cell types. 

The first part of the thesis describes an in vitro analysis of these putative TR response elements. We developed SOSHI-seq (Screening of self-transcribed hormone-inducible elements sequencing), a high-throughput in vitro reporter assay adapted from STARR-seq.  In the SOSHI-seq, candidate DNA fragments are placed in the transcribed portion of a plasmid vector. The eventual enhancer activity of a DNA fragment enables it to reinforce its own transcription in a T3 dependent manner. SOSHI-seq is thus a general procedure to test the presence of functional T3-responsive elements in genomic DNA fragments. Screening 2,000 fragments, we identified around 500 T3-activated elements, many containing canonical DR4 motifs (AGGTCANNNNAGGTCA). Luciferase assays confirmed SOSHI-seq findings, and point mutation analyses on specific fragments showed that DR4 motifs were often necessary and sufficient for T3 responsiveness.  

To profile genes in vivo, we treated mice with propylthiouracil to deplete TH. We then treated the mice with TH and performed single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) on the mediobasal hypothalamus of mice, combined with bulk RNA-seq in sorted cell types: astrocytes, oligodendrocytes, microglia, GABAergic neurons, and tanycytes. We identified 21 cell clusters, with astrocytes showing the strongest response in snRNA-seq. Bulk RNA-seq confirmed and extended gene lists.  

To examine the physiological roles of T3 signaling, we generated two mouse lines expressing a dominant-negative TRα1 in a cell-type-specific manner, targeting astrocytes and oligodendrocytes, respectively, to block T3 signaling in these populations.   Unintended expression of the mutant TRα1 in peripheral tissues, particularly the pancreas, was observed in both lines, precluding an interpretation of the central effects.  

In summary, our study provides a multidimensional analysis of TH signaling in the hypothalamus, combining functional genomics, transcriptomics, and physiological approaches. These findings shed new light on the cell type-specific actions of T3 cells in the brain and highlight the role of the hypothalamus in the regulation of metabolism.