Comprendre les architectures supramoléculaires des nanoparticules lipidiques chargées en ARN messager dans les formulations vaccinales grâce aux spectroscopies RMN et de fluorescence avancées

Résumé de la thèse

L’objectif de cette thèse est d’élucider l’architecture interne des nanoparticules lipidiques (LNPs) utilisées dans les formulations vaccinales à base d’ARN messager, en combinant la résonance magnétique nucléaire (RMN) exaltée par polarisation dynamique nucléaire (DNP) et la spectroscopie de fluorescence. Les LNPs constituent actuellement les vecteurs les plus efficaces pour l’administration de principes actifs à base d’ARN, comme en témoigne le succès des vaccins à ARNm contre le SARS-CoV-2. Toutefois, leur organisation structurelle reste mal comprise, alors qu’elle représente un facteur déterminant pour la stabilité et l’efficacité de la formulation.

Pour répondre à cette problématique, la thèse met en œuvre la RMN du solide sous rotation à l’angle magique (MAS), avec un gain de sensibilité apporté par la DNP. En particulier, des expériences de DNP relayée (R-DNP) sont utilisées pour cartographier la distribution spatiale des composants des LNPs, en exploitant la diffusion de spin pour transférer la polarisation des radicaux externes vers l’intérieur des nanoparticules dépourvues de radicaux. Cette méthode permet d’observer des caractéristiques à l’échelle atomique au sein de systèmes multicomposants à des concentrations pertinentes. En complément, la spectroscopie de fluorescence fournit une lecture orthogonale, basée sur la sensibilité environnementale de sondes solvatochromiques. Ces sondes, fonctionnalisées pour s’insérer à des profondeurs spécifiques au sein des assemblages lipidiques, permettent de détecter des hétérogénéités et des structures de domaines au sein des membranes des LNPs.

En combinant ces approches, la thèse met en évidence les changements dans l’organisation structurale des LNPs en fonction de leur composition (nature des lipides, présence d’ARN) et propose des modèles affinés de leur architecture interne, validés par des simulations numériques ajustées aux données expérimentales. Parallèlement à cette étude principale, des méthodes biochimiques alternatives sont explorées et développées pour incorporer des molécules d’ARN marquées isotopiquement dans les formulations de LNPs. Ces approches visent à améliorer la sensibilité RMN et à permettre une caractérisation structurale et environnementale à l’échelle atomique de l’ARNm encapsulé, avec une résolution accrue.

Understanding supramolecular architectures of mRNA-loaded lipid nanoparticles in vaccine formulations through advanced NMR and fluorescence spectroscopies

The objective of this thesis is to elucidate the internal architecture of lipid nanoparticles (LNPs) used in mRNA vaccine formulations, using a combined approach of dynamic nuclear polarization (DNP)-enhanced nuclear magnetic resonance (NMR) and fluorescence spectroscopy. LNPs are currently the most effective delivery systems for RNA-based therapeutics, as demonstrated by the success of mRNA vaccines against SARS-CoV-2. However, their structural organization remains poorly understood, despite being a critical factor influencing the stability and efficacy of the formulation.

To address this, the thesis employs solid-state NMR spectroscopy under magic-angle spinning (MAS), with sensitivity enhancements provided by DNP. In particular, relayed DNP (R-DNP) experiments are used to map the spatial distribution of LNP components, leveraging spin diffusion to transfer polarization from external radicals to the interior of radical-free nanoparticles. This method enables the detection of atomic-scale features within multicomponent systems at relevant concentrations. Complementary fluorescence spectroscopy provides an orthogonal readout based on the environmental sensitivity of solvatochromic dyes. These tailored probes, functionalized to insert at specific depths within lipid assemblies, enable the detection of heterogeneities and domain structures within LNP membranes.

By combining these approaches, the thesis reveals how LNP structural organization evolves in response to compositional changes (nature of lipids, presence of RNA, ...) and proposes refined models for their internal architecture, validated by numerical simulations fitted to experimental data. In parallel to the main investigation, the thesis explores and develops alternative biochemical methods for the incorporation of isotopically-labelled RNA molecules into LNP formulations. These approaches aim to enhance NMR sensitivity and enable site-specific structural and environmental characterization of encapsulated mRNA at higher resolution.